蒙古族ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1基因R219K多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

袁托亞,王 麗,胡 剛,王悅喜,季英敏,王春燕,于賽華,海 榮

冠心病是危害人類健康的第二殺手,我國(guó)的發(fā)病率雖不及歐美各國(guó),但也有逐年增高趨勢(shì)。研究表明,腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABCA1)基因突變將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流障礙,血漿高密度脂蛋白(HDL-C)極度降低,易早發(fā)冠心病。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(polymerase chain reactionrestriction fragments length polymorphism,PCR-RFLP)分析內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群和蒙古族冠心病人群中R219K多態(tài)性的發(fā)生率,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 共觀察內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族115例,其中男67例,女48例,年齡57.1歲±11.0歲。所有觀察對(duì)象之間沒(méi)有血緣關(guān)系。冠心病組60例,冠狀動(dòng)脈造影確診30例(至少1支冠狀動(dòng)脈直徑狹窄≥50%),根據(jù)臨床癥狀,結(jié)合心電圖、超聲心動(dòng)圖、心肌灌注ECT顯像、64排冠狀動(dòng)脈CT確診30例。對(duì)照組55例,經(jīng)詢問(wèn)病史、體檢、實(shí)驗(yàn)室檢查(血、尿、便常規(guī),血脂,血糖,肝、腎功能)、心電圖、胸片、心臟彩超、心肌灌注 ECT顯像、64排冠狀動(dòng)脈CT、冠狀動(dòng)脈造影等檢查排除冠心病。通過(guò)問(wèn)卷訪談收集研究對(duì)象的基本資料、高血壓病病史、糖尿病病史、既往史、吸煙和飲酒史等。吸煙者的標(biāo)準(zhǔn)為每天吸煙10支以上。剔除標(biāo)準(zhǔn):風(fēng)濕性疾病、大動(dòng)脈炎、梅毒、血液病、結(jié)核、腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平檢測(cè) 所有化驗(yàn)檢查均采用次日清晨空腹采取靜脈血 3 mL,分離血清測(cè)定血脂水平,三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)以氧化酶法測(cè)定,低密度脂蛋白(LDL-C)用PEG變構(gòu)酶法測(cè)定,試劑均為L(zhǎng)eadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS A U 600全自動(dòng)生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3 mL,置于-80℃保存?zhèn)溆?。按照血液、?xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取血液DNA(由TIANGEN公司提供)。

1.2.3 設(shè)計(jì)引物 設(shè)計(jì)PCR引物,引物由Sangon公司合成,上游引物:5′GTA TTTT TGCTACCAGTTACATT TGACAA 3′,下游引物:5′GATTGGCTTCAGGATTGTTGGAA 3′。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系50μ L,包括:2×Taq PCR MasterMix(由 TIANGEN 公司提供)25 μ L,DNA 2.0 μ L,上游和下游引物分別 1.0 μ L(10 μ M),滅菌超純水 21 μ L。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸40 s,共25個(gè)循環(huán);72℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化 酶切反應(yīng)體系30μL:PCR產(chǎn)物

10μL,XagⅠ內(nèi)切酶(由 Fermantas公司提供)1.0 μ L,10×NEB Buffer 2.0μ L,滅菌超純水 18.0 μ L,置于37 ℃酶切 12 h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)并確定樣品基因型。DNA Marker為BioMarkerⅠ(由BioFluk公司提供)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較采用 t檢驗(yàn),兩組以上比較采用one way ANOVA檢驗(yàn)?；蛐秃偷任换蚺c冠心病的相關(guān)性采用比數(shù)比(odds ratio,OR)及其95%的可信區(qū)間(confidence intervals,CI)來(lái)表示。計(jì)數(shù)資料的組間比較用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與對(duì)照組一般資料比較 冠心病組與對(duì)照組在年齡分布上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。常見(jiàn)冠心病危險(xiǎn)因素如糖尿病史、吸煙史、男性率、HDL-C、LDL-C、TG,冠心病組明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),冠心病組高血壓病史與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 ABCA1基因R219K位點(diǎn)多態(tài)性分析 用PCR-RFLP方法測(cè)定發(fā)現(xiàn),R219K擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為177bp,經(jīng)XagⅠ酶切后,K等位基因被切為107bp和70bp兩個(gè)片段,而R等位基因由于無(wú)酶切位點(diǎn)仍為一個(gè)177bp的片段。這樣出現(xiàn)三種大小片段,RR型:純合子GG(177 bp);RK型:雜合子 GA型(177 bp,107 bp,70bp);KK型:純合子AA(107bp,70bp)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 ABCA1基因 R219K多態(tài)性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 冠心病組與對(duì)照組等位基因片段頻率分布 在對(duì)照組中,R和K兩種等位基因片段的頻率分別為48.2%和51.8%,而在冠心病組中分別為60.0%和40.0%。對(duì)冠心病組和對(duì)照組的基因型分布進(jìn)行了平衡檢驗(yàn),χ2檢驗(yàn)表明兩種基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,具有群體代表性。詳見(jiàn)表1。

2.4 冠心病組與對(duì)照組間基因型和等位基因頻率分布比較(見(jiàn)表1)冠心病組KK型分布明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算KK基因型的比數(shù)比OR值=0.411,95%CI(0.17～0.99),基因型KK個(gè)體顯著減少患冠心病的危險(xiǎn)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組ABCA1基因型和等位基因頻率分布

3 討 論

冠心病是一種復(fù)雜的多基因疾病,多種環(huán)境因素和遺傳因素與冠心病的發(fā)病有關(guān)。臨床流行病學(xué)研究表明,遺傳因素在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,從分子遺傳學(xué)角度研究冠心病病因,可為冠心病的預(yù)防和治療提供新的途徑。

1999年人們闡明ABCA1基因變異與丹吉爾病(Tangier disease)、家族性 HDL-C缺乏的發(fā)生密切相關(guān)。ABCA1是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP binding cassette transporter,ABC)超家族的成員。人類ABCA1基因位于9q31,基因全長(zhǎng)149kb。如果ABCA1基因突變,有可能使其編碼的氨基酸改變,從而導(dǎo)致其功能發(fā)生改變,使膽固醇外流障礙[1],膽固醇和膽固醇酯在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚而成為泡沫細(xì)胞,繼而浸潤(rùn)血管壁,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。ABCA1基因是調(diào)節(jié)膽固醇和磷脂代謝平衡的關(guān)鍵途徑,在動(dòng)脈壁,增加ABCA1的表達(dá)可使巨噬細(xì)胞清除自身過(guò)多的膽固醇,從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[2]。除此之外,有研究認(rèn)為,ABCA1還參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展中的程序性細(xì)胞死亡和炎癥等病理過(guò)程[3]。

ABCA1基因R219K位點(diǎn)多態(tài)性分析,第7外顯子第1051 bp位點(diǎn)鳥(niǎo)嘌呤(G)變成腺嘌呤(A),使翻譯的蛋白質(zhì)在219位點(diǎn)精氨酸(R)變成賴氨酸(K),故將其命名為 R219K多態(tài)性。目前,尚未見(jiàn)ABCA1基因的R219K多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中的相關(guān)報(bào)道。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法測(cè)定發(fā)現(xiàn),在蒙古族研究對(duì)象中,ABCA1基因存在RR、RK、KK三種基因型。冠心病組RK型基因頻率和K等位基因頻率低于對(duì)照組,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組KK型基因頻率明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示KK基因型是冠心病發(fā)病的一個(gè)保護(hù)因子,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。初步研究表明同一ABCA1基因多態(tài)性在不同人種之間分布頻率有明顯差異。Singaraja等[5]報(bào)道K等位基因攜帶率在丹麥25.9%,南亞30.3%,加拿大oji-Cree人為37.8%,因紐特人為56.1%。而日本在327名小學(xué)生中做的研究顯示,K等位基因攜帶率竟達(dá)到71%。長(zhǎng)沙地區(qū)漢族攜帶率為43.6%[6],新疆維吾爾族人群攜帶率47.1%[7]。本研究結(jié)果為51.8%。這進(jìn)一步說(shuō)明不同種族人群基因多態(tài)性分布頻率差別明顯,相近種族間分布頻率也有明顯差別[8]。這種差異可能與樣本的選擇和ABCA1基因R219K多態(tài)性種族、族別以及生活飲食習(xí)慣和地域差異有關(guān)。

本結(jié)果提示,ABCAl基因R219K多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群冠心病的遺傳易感性相關(guān),其中KK基因型可能是冠心病的保護(hù)因子。這種作用是否伴有血漿HDL-C水平的顯著改變,今后尚需大樣本的進(jìn)一步研究證實(shí)。

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