宣導(dǎo)瀉肺飲對大鼠心肌細(xì)胞L型Ca2+通道電流影響及機(jī)制研究*

朱 浩 范曉波 賀 勁 廖艷林 楊祥坤湖北省武漢市中醫(yī)院（湖北武漢430014）

心律失常是心血管病常見的致死因素，目前缺乏十分有效的減少心律失常發(fā)生的藥物。本研究采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)來觀察宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清對大鼠心室肌細(xì)胞L-型Ca2+通道的影響，以探討宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清藥理作用相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年SD大鼠 30只，清潔級，體質(zhì)量200～250g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。宣導(dǎo)瀉肺飲濃縮液由武漢中醫(yī)院制劑室提供；小牛血清蛋白（BSA）、膠原酶Ⅱ型、?；撬岷吐然C（CsCl）購自美國Sigma公司；天門冬氨酸合L-谷氨酸由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研所提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純試劑。

1.2 宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清的制備 SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組和宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清組，各15只。含藥血清組按0.55g/kg加蒸餾水3mL，配制成宣導(dǎo)瀉肺飲流浸膏藥液灌服，每日1次，連續(xù)8d。空白血清組給等體積生理鹽水灌胃，方法同含藥血清組。在末次灌胃2h后固定大鼠，眼眶采血。室溫下靜置30min后取上清液，2500r/min離心25min，分離血清，置于56℃水浴30min滅活，過0.22μm孔濾膜濾過除菌，分裝，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 心肌單細(xì)胞的分離 大鼠經(jīng)苯巴比妥鈉麻醉后迅速取出心臟，立即置冰冷飽和氧的無鈣臺(tái)氏液中進(jìn)行修剪，然后經(jīng)主動(dòng)脈將心臟懸掛于Langedorff灌流器上，以正常臺(tái)氏液約8mL連續(xù)灌流5min，然后用無鈣臺(tái)氏液灌流約10min至心臟停搏，換膠原酶液灌流分離心臟單細(xì)胞，待心臟變軟和膨松變大，心肌呈粉紅色半透明時(shí)，可以開始取心臟組織。然后用KB液沖洗殘酶約3～5min，最后將心臟從Langendorff裝置上取下，剪下心室置于37℃冰箱KB液中剪碎，將取下的心室肌組織放于裝有KB液的試管中，在溫育下用粗頭吸管輕輕吹打3～5min，使之分散成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過150～200μm的微孔尼龍膜濾過后于KB液中室溫下（15～25℃）靜置0.5～1h后復(fù)鈣，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 玻璃微電極的制備 1.20mm玻璃微電極，內(nèi)徑0.9～1.1mm，壁厚 0.10～0.15mm，管長100mm，應(yīng)用P-97程控水平微電極拉制器（USA）經(jīng)兩步拉制，調(diào)節(jié)兩步的時(shí)間和速度設(shè)置，拉制出左右兩根電極，充灌電極液后，排除尖端氣泡備用。一般尖端電阻為2～4MΩ。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將復(fù)鈣的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池中，并置于倒置顯微鏡工作臺(tái)上，待細(xì)胞沉底貼壁（5～10min）后，室溫下用臺(tái)氏液或L型鈣通道的細(xì)胞外液灌流，流速2～4mL/min。將充灌電極內(nèi)液（L型鈣通道的電極內(nèi)液）的玻璃微電極安裝在探頭的電極夾持器上。EPC-10double膜片鉗放大器系統(tǒng)通過D/A和A/D轉(zhuǎn)換卡由計(jì)算機(jī)控制刺激發(fā)放和信號(hào)的采集。移動(dòng)Sutter三維電動(dòng)顯微操作器將略帶正壓的電極尖端輕壓在橫紋清晰的桿狀細(xì)胞上，輕施負(fù)壓待吉?dú)W姆封接形成后，正確補(bǔ)償快電容的前提條件下，用驟發(fā)較大負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，小心補(bǔ)償慢電容，打開串聯(lián)電阻補(bǔ)償，將補(bǔ)償率調(diào)至50%～80%左右。全細(xì)胞膜片記錄即告形成。

1.6 觀察宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清對大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的影響 心肌細(xì)胞完成封接破膜補(bǔ)償快慢電容及串聯(lián)電阻后，MODE置向VC后進(jìn)行ICa-L記錄：鉗位電位-40mV，以除極化至0mV，持續(xù)200ms的階躍脈沖激活L-型鈣通道 （ICa-L）：以從-30mV至+60mV，階躍 +10mV，脈寬為200ms的命令電壓鉗制記錄峰值工ICa-L的電流-電壓曲線；電流峰值以內(nèi)向峰電流值與100ms后電流值之差計(jì)算。觀察電極外液灌流（對照組）和宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清10%，30%的稀釋血清后電流幅值和門控動(dòng)力學(xué)的影響。用異搏定（維拉帕米）可阻斷此電流，從而證明此電流為ICa-L（Cs+已將K通道阻斷，鉗位于-40mV Na+通道已失活）。

2 結(jié) 果

2.1 分離細(xì)胞的形態(tài)學(xué) ZEISS倒置顯微鏡（Germany）下可見單個(gè)心室肌細(xì)胞星棒狀或桿狀，細(xì)胞膜表面光滑，橫紋清楚且排列整齊。復(fù)鈣后部分心肌細(xì)胞有自發(fā)性收縮，短時(shí)間內(nèi)攣縮，變圓成死亡細(xì)胞，而大部分呈靜止?fàn)顟B(tài)可供做實(shí)驗(yàn)使用。獲得60%以上橫紋清晰的桿狀耐鈣活細(xì)胞，且可以成活8h以上。

2.2 分離細(xì)胞的鈣電流 壓鉗模式下以10mV的步長使心室肌細(xì)胞由-40mV的鉗位電位逐步去極化至+50mV，刺激持續(xù)250ms，記錄到一個(gè)緩慢失活的內(nèi)向電流，在此條件下，鈉通道和T-型鈣通道幾乎被完全抑制，電極內(nèi)液中又加入了Cs+，可以消除鉀通道電流的影響。在灌流的外液中加入10mmo1/L的維拉帕米可以幾乎完全阻斷上述的電流，實(shí)為慢鈣電流。

2.3 不同濃度宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清對大鼠心室肌細(xì)胞鈣通道電流的影響 見表1、圖1。不同濃度的宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清灌流心室肌細(xì)胞5min明顯抑制ICa-L。沖洗后可見ICa-L有所恢復(fù)，其降低無顯著差異。不同濃度的宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清對心室肌細(xì)胞的Ica-L呈濃度依賴性抑制。圖1示不同深度的宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清作用下的ICa-L電流-電壓曲線，可見其形狀未發(fā)生明顯改變。

3 討 論

心律失常的發(fā)生與心肌電生理特性異常有關(guān)，而心肌電生理特性又與心肌細(xì)胞上的Ca2+離子通道密切相關(guān)[1-3]。目前臨床上使用的抗快速性心律失常西藥有4類，除Ⅱ類屬于β受體阻斷劑以外，其余均作用于不同的離子通道，而產(chǎn)生抗心律失常的作用。目前心血管人工合成藥的研究較多，因此人們已將其注意力轉(zhuǎn)移到天然藥物和中藥的研究上，且隨著分離技術(shù)的發(fā)展和提高，抗心律失常中藥的研究已經(jīng)從復(fù)方、單味藥深入到有效的單體成分上[4]，現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)抗心律失常的中藥單體有十幾種，如：黃連素，鉤藤堿，紅花黃素，關(guān)附甲素，人參三醇等[5-8]，從目前對它們抗心律失常的電生理的研究來看，大多數(shù)是屬于Ⅲ類抗心律失常藥。

表1 不同濃度宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清對不同電壓下大鼠心室肌細(xì)胞 ICa-L（pA）的影響 (n=6，±s）

表1 不同濃度宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清對不同電壓下大鼠心室肌細(xì)胞 ICa-L（pA）的影響 (n=6，±s）

與對照組、沖洗后比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

電壓（mV）-30-20對照組21.50±9.40 127.10±36.50 10%含藥血清組13.30±4.30**101.90±44.50 30%含藥血清組10.10±2.90**89.60±27.20**沖洗后19.20±3.90 123.30±46.70-10 299.70±89.90 227.10±87.10 182.10±45.70** 270.00±84.80 0 586.50±111.30 449.40±107.70 311.10±99.70** 544.00±136.90 10 631.30±156.50 537.70±135.10* 36.00±123.70** 610.20±135.80 20 580.90±121.30 481.60±97.70* 317.10±117.10** 551.40±136.50 30 475.30±139.30 390.30±95.10* 226.10±67.30** 446.00±95.80 40 276.70±36.50 201.10±44.50** 140.10±37.10** 223.10±46.70 50 127.10±36.50 101.90±44.50 63.70±5.50** 117.30±46.70 6016.70±7.1012.70±6.209.20±2.80**14.50±5.70

圖1 不同濃度宣導(dǎo)瀉肺飲含藥血清作用下Ica-L的電流-電壓曲線

眾所周知，動(dòng)作電位的去極化（0期）是與Na+離子通道開放，Na+內(nèi)流有關(guān)；而復(fù)極化均與 K+，Ca2+通道有關(guān)，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)與心肌復(fù)極化有關(guān)的K+電流有多種，主要有一過性外向鉀電流、內(nèi)向整流鉀電流和延遲整流鉀電流。有報(bào)道認(rèn)為，內(nèi)向整流鉀電流主要作用維持心肌細(xì)胞的靜息電位和動(dòng)作電位3期快速復(fù)極過程，延遲整流鉀電流則參與整個(gè)復(fù)極過程并與ICa一起共同維持動(dòng)作電位復(fù)極化2期，而細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌缺血/再灌注損傷的中心環(huán)節(jié)，對細(xì)胞的損傷起關(guān)鍵作用。

宣導(dǎo)瀉肺飲是筆者課題組在葉天士經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，加以化裁用以治療心悸的經(jīng)驗(yàn)方，方中主要藥物組成為：葶藶子、桑白皮、杏仁、厚樸、陳皮、萊菔子、豬苓、澤瀉、川木通、當(dāng)歸。本方用藥，三焦兼顧，而以葶藶子、桑白皮開宣上焦為君，萊菔子、豬苓分入中下二焦為臣，余藥助君臣之力為佐。諸藥合用，宣上和中滲下，使上宣中和下達(dá)，三焦氣機(jī)通暢，共奏宣導(dǎo)三焦，瀉肺豁痰，活血利水之功。藥理研究發(fā)現(xiàn)宣導(dǎo)瀉肺飲組方中主藥葶藶子有強(qiáng)心作用，使家兔心電圖見有P波變低和洋地黃型的雙向T波等[9]。

本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞膜鉗技術(shù)，進(jìn)一步在分子水平研究宣導(dǎo)瀉肺飲對Ca2+通道的影響，結(jié)果表明，宣導(dǎo)瀉肺飲對Ca2+通道有抑制作用。在分離的單個(gè)心室肌細(xì)胞上所記錄到的Ca2+電流其特性，具有電壓依賴性，在去極化時(shí)被激活。因此推測宣導(dǎo)瀉肺飲可能是通過抑制慢鈣通道來縮短APD，APD50，從而縮短有效不應(yīng)期，發(fā)揮其抗心律失常的作用。

本研究證明宣導(dǎo)瀉肺飲可抑制電壓門控性鈣通道的外鈣內(nèi)流和減少肌漿網(wǎng)的內(nèi)鈣釋放，從而減少大鼠心室肌細(xì)胞[Ca2+]i，對心室肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

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