FHIT蛋白及mRNA在食管癌組織中的表達(dá)及意義

張德慶,陳東育,宋兆峰

(泰安市中心醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.風(fēng)濕免疫科;3.心血管內(nèi)科,山東 泰安271000)

脆性組氨酸三聯(lián)體(fragi1ehistidinetriad,FHIT)基因是一種抑癌基因,與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。人們對(duì)其深入探討,發(fā)現(xiàn)該蛋白在多種腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生廣泛的缺失和失活[1、2],在消化道腫瘤亦發(fā)現(xiàn)FHIT基因表達(dá)異常[3]。本文采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食管癌及相應(yīng)癌旁組織的FHIT蛋白和mRNA表達(dá)情況,從而探討FHIT與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,以及在食管癌的診斷、治療以及預(yù)后判斷等方面的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院腫瘤外科自2006年4月至2007年1月收治的50例食管癌患者的食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織,同期從我院內(nèi)鏡室收集30例正常食管組織。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí),臨床資料完整。50例食管癌均為食管鱗癌,其中男性31例,女性19例,年齡35-75歲,平均年齡53歲。依據(jù)1987年頒發(fā)的國(guó)際統(tǒng)一的食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn),TNM分期:Ⅰ期8例,Ⅱ期10例,Ⅲ期19例,Ⅳ期13例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療及放療。

1.2 方法

1.2.1RT-PCR 將手術(shù)切取凍存的食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織制備成懸液,總RNA提取按Trizol試劑盒一步法提取。按試劑盒(試劑盒均為寶生物工程有限公司合成提供)要求的條件合成cDNA,所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:94℃2 min預(yù)變性,94℃變性40 sec,55℃退火40 sec,72℃延伸40 sec,共36個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min。基因引物序列及擴(kuò)增片段見表1。

表1 FHIT基因引物序列及擴(kuò)增片段

1.2.2免疫組化 采用SP免疫組化檢測(cè)法,抗FHIT多克隆抗體(一抗)和免疫組化染色超敏試劑盒(北京中山試劑公司)。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性,并根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)及反應(yīng)強(qiáng)度制定如下判斷標(biāo)準(zhǔn)。按染色強(qiáng)度打分:3分為深棕色,2分為淺棕色,1分為淺黃色,0分為不染色。按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:0分為無陽性細(xì)胞,1分為陽性細(xì)胞數(shù)≤10%,2分為陽性細(xì)胞數(shù)11%-50%,3分為陽性細(xì)胞數(shù)51%-75%,4分為陽性細(xì)胞數(shù)＞75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積位于0-2分為缺失表達(dá),2-3分為弱表達(dá),＞3分的為正常表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

2.1.1部分食管癌組織中FHIT基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

2.1.2FHIT mRNA的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 不同類型組織中FHIT mRNA的缺失率

癌組織中FHIT mRNA缺失率82%,癌旁組織中22%,正常組織中16.7%,癌組織中FHIT表達(dá)與其他兩種組織比較均有顯著性差異(P＜0.001)。

2.2 FHIT蛋白在不同組織中的表達(dá)情況。

2.2.1FHIT蛋白的免疫組化結(jié)果見圖2。

圖1 FHIT基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 FHIT蛋白的正常表達(dá)

FHIT蛋白在正常食管組織呈正常表達(dá)(如圖2),正常上皮細(xì)胞排列規(guī)則整齊,胞質(zhì)染色均勻清晰;癌細(xì)胞陽性染色區(qū)細(xì)胞排列雜亂,染色不均一,陽性細(xì)胞數(shù)少或消失。

2.2.2不同類型組織中FHIT蛋白的檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 不同類型組織中FHIT蛋白表達(dá)的百分率

癌組織中FHIT蛋白缺失率66%,癌旁組織中18%,正常組織中6.7%,癌組織中FHIT蛋白與其他兩種組織比較均有顯著性差異(P＜0.001)。

2.3 不同病理類型的癌組織中FHIT基因及蛋白檢測(cè)結(jié)果 見表4。

表4 不同病理類型癌組織中FHIT蛋白和mRNA的表達(dá)

3 討論

食管癌和其他惡性腫瘤一樣,已被公認(rèn)為一種基因性疾病,多種癌基因和抑癌基因協(xié)同作用而導(dǎo)致食管癌的發(fā)生發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,抑癌基因在食管癌中的作用已越來越受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)腫瘤中,FHIT表達(dá)出現(xiàn)頻繁降低或丟失,腫瘤的發(fā)生與FHIT基因轉(zhuǎn)錄缺失有關(guān),提示FHIT基因?yàn)槎喾N腫瘤的候選抑制基因[4]。

本研究中我們檢測(cè)了FHIT蛋白和mRNA在三種組織中的表達(dá),結(jié)果表明FHIT蛋白和mRNA在癌組織中的表達(dá)是一個(gè)漸進(jìn)的過程,隨著癌前細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,FHIT的兩種表達(dá)逐漸減低。因此,FHIT基因表達(dá)的缺失提示組織學(xué)上正常的組織存在癌變的可能,具有早期診斷價(jià)值。另外,FHIT在癌組織中缺失率明顯高于癌旁組織和正常組織,它表明在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中FHIT基因的表達(dá)缺失或減弱可能降低了其抑癌基因的功能而增加了食管癌的易感性。由表4的結(jié)果可以看到FHIT在癌組織中的陽性表達(dá)率隨著病理分期越晚,FHIT陽性表達(dá)率呈下調(diào)趨勢(shì);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中FHIT陽性表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織提示FHIT陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān);而在高分化、中分化、低分化鱗癌組織中,FHIT基因表達(dá)的缺失率隨分化程度越低,呈逐漸增高趨勢(shì),但兩兩比較無顯著性差異(P＞0.05),提示食管癌組織中FHIT基因的陽性表達(dá)與癌組織分化程度可能無關(guān)。

目前,提高食管癌5年生存率的關(guān)鍵仍然是早期診斷,而早期診斷的關(guān)鍵是能否找到一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法,針對(duì)各種異?；虻臋z測(cè)為我們開辟了新的思路。郭曉青[5]等檢測(cè)血漿中FHIT基因的甲基化發(fā)現(xiàn),患者的腫瘤中表現(xiàn)出了血漿中FHIT基因的甲基化,病理分級(jí)為Ⅰ級(jí)及腫瘤長(zhǎng)徑小于2cm的腫瘤患者被檢測(cè)出血漿DNA中FHIT基因的異常,表明血液中DNA的FHIT基因的檢測(cè),有望成為食管癌早期診斷的一個(gè)較好方法。Askari等[6]開發(fā)出一種利用高效熒光檢測(cè)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)FHIT DNA及蛋白表達(dá)的多功能生物芯片,它具有靈敏性、選擇性和直接性等優(yōu)點(diǎn)。隨著基因異常與食管癌發(fā)生、發(fā)展二者之間相關(guān)關(guān)系的確定,人們已開始探討針對(duì)基因異常的若干實(shí)驗(yàn)性治療方法在食管癌治療中的意義及價(jià)值。

綜上所述,FHIT蛋白和mRNA的表達(dá)缺失和下調(diào)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),兩種指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)為食管癌早期診斷和預(yù)后判斷提供了依據(jù)。但是作為與食管癌發(fā)生相關(guān)的候選抑癌基因,FHIT基因在食管癌的診斷、治療、預(yù)后等方面的價(jià)值還有待于更深入的研究。

[1]Andachi H,Yashima K,Koda M,et al.Reduced FHIT expression is associated with mismatch repair deficiency in human advanced colorectal carcinoma[J].Br Cancer,2002,87:441.

[2]Noguchi T,Takeno S,Kirura Y,et al.FHIT expression and hyper methylation in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int Mof Med,2003,11:441.

[3]Stec-M ichalska K,Antoszczyk S,Klupinska G,et al.Loss of FHIT expression in gastric mucosa of patientswith family histories of gastric cancer and helicobacter pylorinfection[J].World J Gastroenterol,2005,11:17.

[4]Sorio C,Baron A,Orlandini S,et al.The FHIT gene is expressed in pancreatic ductular cells and is altered in pancreatic cancers[J].Cancer Res,1999,59(6):1308.

[5]郭曉青,王士杰,叢慶文.血漿p16和FHJT基因甲基化在食管癌及癌前病變檢測(cè)的臨床意義[J].腫瘤,2006,26(9):832.

[6]AskariMD,MillerGH,Vo Dinh T,et al.Simultaneous detection of the tumor suppressor FH IT gene and protein using themultifunctional biochip[J].Camcer Detect Prev,2002,26:331.