蛋黃中膽固醇含量測定方法的研究

張 旭，胡 艷，蔣桂韜，王向榮，李昊幫，戴求仲

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131）

雞蛋是一種營養(yǎng)豐富的食品，是居民主要消費的畜產品之一。雞蛋中膽固醇的含量較高，約為213mg·個-1，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋等具有一定保健功能的雞蛋受到人們關注，因而有必要對雞蛋的膽固醇含量進行分析[1-5]。另外，目前市場上雞蛋品種繁多，生產者或研究者需要對雞蛋的營養(yǎng)成分進行分析，從而評定其營養(yǎng)價值，這些都需要有準確的分析雞蛋膽固醇含量的方法。膽固醇主要存在于蛋黃中，因此，測定雞蛋中膽固醇含量多以蛋黃為樣本進行測定。膽固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法等，試劑盒法是基于酶法測定膽固醇的原理進行的，比色法一種依據(jù)顯色反應來分析的傳統(tǒng)方法，色譜法是適用范圍較廣、靈敏度較高的分析方法，而高效液相色譜不需要載氣，在使用上較氣相色譜和液相色譜-質譜聯(lián)用的方法簡便[6-11]。本試驗對液相色譜法、皂化-比色法和試劑盒法測定蛋黃膽固醇的過程和結果進行研究和比較，為雞蛋膽固醇含量測定工作提供方法指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛋黃由市售新鮮雞蛋中取出；膽固醇標準品，純度≥99.7%（由中國計量科學研究院提供）；總膽固醇試劑盒（酶法）由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；顯色液為FeSO4-冰乙酸-濃硫酸，將Fe?SO4100mg溶于1mL蒸餾水中，再加入100 mL冰乙酸混合溶解，然后與100 mL濃硫酸緩慢混勻，冷卻后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 HPLC法

取新鮮蛋黃稀釋液（濃度為0.1 g·mL-1）1.0 mL于10 mL離心管中，加入95%乙醇1.0 mL，用漩渦振蕩器混勻后，加入乙醚2.5 mL，再次混勻后加入石油醚2.5 mL，震蕩混勻，3000 rpm離心5 min，移出上層萃取液，在低于45℃下用氮氣吹干，加無水乙醇溶解殘余物2.0 mL，用0.45 μm有機微孔濾膜過濾后進樣。色譜條件為色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；流動相：乙腈-異丙醇（4∶1，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。取膽固醇標準品用色譜級無水乙醇溶解配成濃度為1mg·mL-1的標準液，取標準液稀釋成不同濃度（0～1000 μg·mL-1），以膽固醇濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標制作標準曲線。采用外標法定量分析樣品中膽固醇含量。

1.2.2 皂化-比色法

稱取鮮蛋黃100mg于25 mL試管中，加入KOH-甲醇溶液5 mL（200 g·L-1），漩渦震蕩混勻，置于80℃水浴恒溫振蕩器中皂化10 min，取出冷卻至室溫，加入正己烷10 mL，漩渦震蕩混勻，靜置，將上層液體移入10 mL離心管中，3000 rpm離心10 min，取出上清液60℃下用氮氣吹干。然后加入冰乙酸1 mL溶解殘余物，再加入顯色液3 mL于60℃水浴15 min，在490 nm下用722分光光度計進行比色分析，同法做空白樣。將膽固醇標準品用甲醇溶解配成1mg·mL-1溶液，取不同體積膽固醇標準品溶液與樣品做同樣處理，以膽固醇濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標制作工作曲線。根據(jù)樣品的吸光度值計算樣品中膽固醇含量。

1.2.3 試劑盒法

樣品前處理方法同1.2.1，根據(jù)試劑盒說明將樣品與工作液混合，37℃保溫5 min后，在波長500 nm處比色測定吸光度值，并根據(jù)樣品管和校準管的吸光度值及校準品濃度計算膽固醇含量，計算式見式（1）。

1.2.4 加標回收率的測定

量取0.1 g·mL-1新鮮蛋黃稀釋液0.5 mL或新鮮蛋黃50mg，加入1mg·mL-1的膽固醇標準液750 μL，按照上述3種方法進行處理并分析，根據(jù)結果計算加標回收率。計算公式見式（2）。

其中，a為測得加標樣中膽固醇的量，b為樣品中膽固醇的量，c為加標量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，結果以“平均值±標準誤”表示。

2 試驗結果

2.1 HPLC法測定蛋黃膽固醇含量

樣品的高效液相色譜圖見附圖。

由附圖可知，膽固醇的保留時間為14.662 min。

2.2 測定結果比較

3種方法測定結果見附表。

通過對3種方法的比較發(fā)現(xiàn)，HPLC法的測定結果低于皂化-比色法，但差異不顯著（P＞0.05），而試劑盒法的測定結果較HPLC法高（P＜0.05），這與Nogueira的結果相一致[12]。

附圖 樣品的液相色譜圖

附表 3種測膽固醇方法比較%

目前我國產膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒，其測定原理是膽固醇在膽固醇氧化酶的作用下生成膽甾烯酮，再與氨基安替吡啉反應生成紅色醌化物，醌化物顏色深淺與膽固醇含量成正比，試劑盒法測定結果較高的原因可能是蛋黃中固醇以外的甾醇類物質也同氨基安替吡啉反應生成有色物，使測定結果偏高[13]。HPLC法測定蛋黃膽固醇結果的偏差最小，方法的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性也好于其他兩種方法，因而HPLC法的精密度較高。皂化-比色法的偏差較大，其原因可能是此法采用皂化、顯色等多步操作，增加了由儀器、試劑和操作等方面帶來的系統(tǒng)誤差，另外，蛋黃中膽固醇以外的物質也可能與硫酸反應而生成有色物，給測定結果帶來干擾。試劑盒法的精密度最低，這可能與蛋黃樣品中干擾物質較多有關。在樣品中加入膽固醇標準品分析加標回收率的結果表明，HPLC法的回收率最好，因而準確度最高，皂化-比色法居中，試劑盒法的準確度最低。皂化-比色法的加標回收率偏低，可能與膽固醇皂化不完全有關，皂化時間短，樣品中膽固醇未能被完全皂化，但皂化時間長又可能會使樣品中增加膽固醇以外的皂化產物而干擾測定結果。試劑盒法的加標回收率偏高，一方面與甾醇干擾有關，另一方面，本研究采用手工量取試液在722分光光度計上進行分析，而非全自動機器操作，增大了系統(tǒng)誤差。

3 討論

這3種測定方法中HPLC法以其高效、高速、高靈敏度的特點成為測定蛋黃膽固醇含量最準確的方法，皂化-比色法檢測雖然不需要昂貴的儀器，但顯色液使用濃硫酸配制，使用和分析過程中有一定危險，且蛋黃中干擾物質多使測定的結果偏差較大[14]。在采用皂化-比色法分析時，為了提高結果的準確性，本研究用膽固醇標準品制作工作曲線而非標準曲線，即將膽固醇標準品做皂化和提取處理，然后加入顯色液，整個處理過程與樣品相同。目前我國產膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒，用試劑盒測定血清膽固醇的方法已被廣泛使用，但用血清總膽固醇試劑盒測定蛋黃膽固醇含量存在結果偏高，偏差大的問題。譚觀岳等在對鰻魚的試驗中也得到相似的結論，另有研究者將氣相色譜法測定的結果與試劑盒法比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒法的測定結果也偏高，而色譜法能夠將膽固醇和其他甾醇有效的分離，準確度高[15-16]。

采用HPLC法測蛋黃膽固醇應使用新鮮蛋黃，不宜使用冷凍蛋黃樣品，蛋黃冷凍后會發(fā)生凝膠化而很難均勻分散在水中；樣品處理后用0.45 μm濾膜過濾至EP管中，應盡量將EP管裝滿，以避免膽固醇與氧氣接觸而發(fā)生氧化；樣品前處理時萃取液采用氮吹儀吹干，亦可用真空干燥箱低溫烘干；流動相要脫氣，測樣時保持柱溫恒定，避免保留時間偏移。

4 結 論

高效液相色譜法測定蛋黃膽固醇含量，方法可靠、準確、簡便，重現(xiàn)性和再現(xiàn)性好。皂化-比色法的準確性較HPLC法低，較試劑盒法高。用總膽固醇試劑盒測定蛋黃膽固醇含量的結果偏高，不建議使用血清總膽固醇試劑盒來測定蛋黃的膽固醇含量。

[1]張旭,戴求仲,蔣桂韜,等.生產低膽固醇雞蛋的營養(yǎng)調控方法[J].飼料博覽,2010（6）:14-16.

[2]李志瓊.α-亞麻酸對產蛋雞脂質代謝及蛋黃膽固醇沉積的影響及其機理[M].雅安:四川農業(yè)大學,2007.

[3]Chamruspollert M,Sell J L.Transfer of dietary conjugated linoleic acid toegg yolks of chickens[J].Poult Sci,1999,78（8）:1138-1150.

[4]Ankari A A,Najib H,Hozab A A.Yolk and senum cholesteroland production traits,as affected by incorporating a supraoptimala?mount of copper in the diet of the Leghorn hen[J].Br Poult Sci,1998,39:393-397.

[5]侯永剛,陳輝,黃仁錄,等.苜蓿皂甙對蛋雞生產性能、屠體指標、膽固醇及血清脂質的影響[J].中國畜牧雜志,2009,49（17）:30-33.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.128-2003.食品中膽固醇的測定[S].2003.

[7]葛慶聯(lián),葛慶豐,劉迪,等.禽蛋中膽固醇的酶催化分光光度測定法研究[J].食品科學,2009,30（2）:208-210.

[8]張蓉真,李瓏,劉樹滔,等.測定雞蛋膽固醇的高效液相色譜新方法[J].色譜,1998,16（2）:91-94.

[9]中華人民共和國農業(yè)部.NY/T 1032-2006.飼料中膽固醇含量的測定[S].2006.

[10]盛靈慧,王晶,武利慶,等.液相色譜-質譜聯(lián)用測定蛋粉中膽固醇含量[J].食品科學,2008,29（12）:632-634.

[11]張佳程,駱承庠,黃赤男,等.直接皂化-比色法測定食品中膽固醇的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26（3）:35-38.

[12]Nogueira G C,Bragagnolo N.Assessment of methodology for the enzymatic assay of cholesterol in egg noodles[J].Food Chemistry,2002,79（2）:267-270.

[13]Ulberth F,Reich H,Gas H.Chromatographic determination of cholesterol in processed foods[J].Food Chemistry,1992,43（5）:387-391.

[14]Han C K,Lee N H.Yolk cholesterol content in eggs from the ma?jor domestic strains of breeding hen[J].Australasian Journal of American Studies,1992,5（3）:461-464.

[15]譚觀岳,傅紅,楊琳.HPLC和試劑盒兩種測定鰻魚膽固醇方法的比較[J].食品研究與開發(fā),2008,29（4）:148-150.

[16]Beyer R S,Jensen L S.Overestimation of the cholesterol content of eggs[J].Journal of Agricultural Food Chemistry,1989,37（4）:917-920.