筋脈通膠囊對(duì)糖尿病大鼠陰莖組織一氧化氮合成酶表達(dá)的影響

樸元林 梁曉春 吳群勵(lì) 孫連慶 屈嶺 王普艷 趙麗

近年來(lái)的臨床研究證實(shí)神經(jīng)病變?cè)谔悄虿〔鸸δ苷系K的發(fā)病中起著非常重要的作用[1，2]。已有研究表明糖尿病病人及糖尿病模型動(dòng)物的陰莖組織中神經(jīng)型一氧化氮合成酶(nNOS)表達(dá)減低，提示存在勃起神經(jīng)損害[3，4]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)中藥筋脈通膠囊能夠改善糖尿病周圍神經(jīng)病變，提高糖尿病周圍神經(jīng)病變患者及鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病(STZ-DM)大鼠的坐骨神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，增加STZ-DM大鼠周圍神經(jīng)組織的神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)[5]，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究采用STZ-DM大鼠模型，觀察筋脈通對(duì)其陰莖組織NOS表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～9周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠，體重230～265 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：京2007-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

筋脈通膠囊(由菟絲子、女貞子、桂枝、水蛭、元胡、細(xì)辛等藥物組成)，為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑，由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)，每粒含生藥0.35 g，批準(zhǔn)文號(hào)(97)京衛(wèi)藥制加字[48]第F-292 號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)061019。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Calbiochem公司。神經(jīng)妥樂(lè)平(NEUT)購(gòu)自日本臟器制藥株式會(huì)社，每片含4NU，批準(zhǔn)文號(hào)S20040071，生產(chǎn)批號(hào)06180。兔抗鼠nNOS單克隆抗體購(gòu)自abcam公司，批號(hào)ab76067；iNOS兔抗鼠多克隆抗體，AGEs兔抗鼠多克隆抗體及3,3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自博士德公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立和分組干預(yù)

60只雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取其中10只為正常組。禁食12小時(shí)后按60 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射0.45%的STZ溶液(pH 4.2)，72小時(shí)后測(cè)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。將糖尿病模型大鼠再隨機(jī)分為模型組、筋脈通小劑量組、筋脈通中劑量組、筋脈通大劑量組及神經(jīng)妥樂(lè)平組，每組各10只。成模后即開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)16周。筋脈通小、中及大劑量組分別按成人劑量的5倍、10倍及20倍(即0.4375 g·kg-1·d-1、0.875 g·kg-1·d-1及1.75 g·kg-1·d-1)給藥，NEUT組以成人劑量的10倍即2.67 nU·kg-1·d-1給藥。正常組和模型組按0.01 ml/g每日灌喂蒸餾水。

1.4 體重及血糖檢測(cè)

每4周取大鼠尾尖血，以羅氏快速血糖測(cè)定儀和血糖試紙條測(cè)定血糖，每次測(cè)血糖前均稱體重。

1.5 標(biāo)本處理

所有實(shí)驗(yàn)大鼠于灌胃第16周末處死。用12%烏拉坦10 ml/kg腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，取中段陰莖組織, 置于10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,待查免疫組化染色。

1.6 免疫組化染色及檢測(cè)方法

免疫組化染色采用EnVision法，使用Dako Cytomation免疫組化自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行染色。

免疫組織化學(xué)染色步驟：切片厚度4 μm，68℃烤片45分鐘；三步二甲苯脫蠟,每步15分鐘；進(jìn)無(wú)水酒精；進(jìn)3%H2O2溶液室溫孵10分鐘；梯度酒精水化(無(wú)水，95%，80%)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，5分鐘×3次；滴加一抗(兔抗鼠多克隆AGEs抗體或兔抗鼠nNOS單克隆抗體，稀釋比例1∶100)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗，5分鐘×3次；滴加稀釋比例1∶200二抗生物素化的羊抗兔IgG，EnVision室溫孵育45分鐘，PBS沖洗，5分鐘×3次；DAB 顯色；蘇木精復(fù)染；常規(guī)脫水、透明、封片。

陰莖平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)及神經(jīng)纖維被染為棕黃色為陽(yáng)性。通過(guò)Nikon Eclipse 80i顯微鏡、微視Mcv2000 圖像采集系統(tǒng), 采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件,對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析。每組各隨機(jī)取8只大鼠,每只大鼠觀察2張切片,每張切片在200倍光鏡下選取5個(gè)互不重疊視野,測(cè)量每個(gè)視野的累積吸光度(IOD) ,各取均值為1只大鼠的結(jié)果,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況、血糖及體重

與正常大鼠比，糖尿病模型大鼠的血糖明顯升高、體重明顯下降；糖尿病大鼠各組之間的血糖及體重?zé)o顯著性差別，具體結(jié)果參見本課題組既往的研究報(bào)道[5]。

2.2 nNOS及iNOS免疫組化染色分析

2.2.1 nNOS免疫組織化學(xué)結(jié)果

光鏡下觀察，nNOS陽(yáng)性染色的神經(jīng)纖維散在分布，呈棕黃色。與正常組比較，模型組、神經(jīng)妥樂(lè)平組、筋脈通小劑量組和筋脈通大劑量組的IOD數(shù)值明顯減低(P<0.01)。與正常組比較，筋脈通中劑量組的IOD數(shù)值，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。模型組、神經(jīng)妥樂(lè)平組、筋脈通小劑量組和筋脈通大劑量組，各組之間的IOD數(shù)值比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與模型組比較，筋脈通中劑量組的IOD數(shù)值顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與神經(jīng)妥樂(lè)平組比較，筋脈通中劑量組的IOD數(shù)值顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.2.2 iNOS免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

光鏡下觀察，iNOS陽(yáng)性染色的陰莖平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，各組間IOD數(shù)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05) 。見表1。

表1 各組大鼠陰莖組織nNOS、iNOS表達(dá)IOD值比較

3 討論

一氧化氮(NO)及其介導(dǎo)的平滑肌松弛是陰莖勃起過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[6]。性刺激時(shí)，陰莖海綿體內(nèi)非腎上腺素非膽堿能神經(jīng)末梢和血管內(nèi)皮細(xì)胞在NOS的催化下合成并釋放NO。NO活化胞質(zhì)內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，后者把鳥嘌呤三磷酸(GTP)轉(zhuǎn)化為環(huán)鳥苷磷酸(cGMP)，cGMP激活蛋白激酶G，降低平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度，從而引起平滑肌松弛。研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病動(dòng)物由電刺激引發(fā)的海綿體松弛功能已出現(xiàn)障礙,提示存在非腎上腺素非膽堿能神經(jīng)損害[7],而在2型糖尿病人及2型糖尿病大鼠中均已證實(shí)陰莖組織中nNOS表達(dá)減低[3,4]。

糖尿病勃起功能障礙即中醫(yī)消渴病兼證“陽(yáng)痿”。氣陰兩虛、腎虛血瘀是消渴病陽(yáng)痿的主要中醫(yī)病機(jī)。筆者在臨床觀察到糖尿病ED病人以陰虛證、血瘀證和氣虛證為多見，隨著病程延長(zhǎng)陽(yáng)虛證及血瘀證表現(xiàn)加重、勃起功能越差[8]。筋脈通是由菟絲子、女貞子、水蛭、元胡、桂枝、細(xì)辛等組成,其中菟絲子和女貞子溫陽(yáng)育陰、平補(bǔ)腎之陰陽(yáng)；元胡和水蛭活血化瘀；桂枝、細(xì)辛溫經(jīng)通脈。全方配伍具有補(bǔ)腎活血、溫經(jīng)通脈之功，符合消渴病陽(yáng)痿中醫(yī)病機(jī)。

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠陰莖組織nNOS的表達(dá)降低，筋脈通可以明顯提高糖尿病大鼠陰莖組織nNOS的表達(dá)。本課題組既往研究表明，筋脈通可抑制多元醇代謝途徑的激活、抗氧化應(yīng)激、減少核因子κB的表達(dá)、上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子及睫狀體神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)、減少非酶糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的生成并下調(diào)AGEs受體異常表達(dá)，具有保護(hù)糖尿病周圍神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)、促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)與再生作用[5，9-15]。因此，推測(cè)筋脈通升高糖尿病大鼠陰莖組織nNOS表達(dá)可能與其多途徑多靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

本研究觀察到筋脈通改善糖尿病大鼠陰莖組織nNOS表達(dá)降低的作用，并非濃度依賴。本課題組以往的研究[5]也觀察到筋脈通的作用呈非濃度依賴的情況，有待進(jìn)一步的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效學(xué)研究。通常認(rèn)為，誘導(dǎo)型的NOS(iNOS)在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)表達(dá)，并在病理生理?xiàng)l件下表達(dá)升高[16]。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠的陰莖海綿體iNOS mRNA的表達(dá)升高，提示糖尿病引起的海綿體內(nèi)應(yīng)激增加[17]。本研究的各組之間的iNOS表達(dá)無(wú)明顯差別，有待將來(lái)的更進(jìn)一步研究。

總之，筋脈通能提高糖尿病大鼠陰莖組織nNOS表達(dá)，可能有助于改善糖尿病勃起功能障礙，有待進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

[1] Bleustein CB,Arezzo JC,Eckholdt H，et al.The neuropathy of erectile dysfunction[J].Int J Impot Res，2002，14(6)：433-439.

[2] Hecht MJ，Neund?rfer B，Kiesewetter F，et al. Neuropathy is a major contributing factor to diabetic erectile dysfunction[J]. Neurol Res，2001，23(6):651-654.

[3] Vernet D, Cai L,Garban H,et al.Reduction of penile nitric oxide synthase in diabetic BB/WOR(dp)(type I)and BBZ/WOR(dp)(type II) rats with erectile dysfunction[J].Endocrinology, 1995,136(12):5709-5717.

[4] Chiou WF,Liu HK,Juan CW.Abnormal protein expression in the corpus cavernosum impairs erectile function in type 2 diabetes[J].BJU Int,2010,105(5):674-680.

[5] 屈嶺，梁曉春，吳群勵(lì)，等. 筋脈通對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志，2008，33(21)：2539-2544.

[6] Snow KJ.Erectile dysfunction:A review and update[J].Formulary,2004,39:261-268.

[7] Gratzke C,Angulo J,Chitaley K,et al.Anatomy,physiology,and pathophysiology of erectile dysfunction[J].Journal of Sexual Medicine,2010,7(1):445-475.

[8] 樸元林,孫連慶,吳群勵(lì)，等.糖尿病性勃起功能障礙的中醫(yī)證候研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2010,17(3):152-154.

[9] 梁曉春,張宏,郭賽珊,等.筋脈通對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、醛糖還原酶及山梨醇濃度的影響[J].中國(guó)糖尿病雜志,2000,8(1):37-39.

[10] Qu Ling,Liang xiao-chun,Zhang Hong,et al.Effect of Jinmaitong Serum on the proliferation of rat Schwann cells cultured in high glucose medium[J].Chinese Journal of Integrative Medicine,2008,14(4):293-297.

[11] 孫連慶,梁曉春,張宏,等.中藥筋脈通對(duì)高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞增殖及NGF表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜,2009,24(8):1019-1022.

[12] 黃文智,梁曉春,王普艷，等.筋脈通對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)AGEs及其受體表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(4):806-809.

[13] 王普艷，梁曉春, 張宏,等.筋脈通膠囊對(duì)高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞睫狀體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中醫(yī)雜志,2010,51(8):736-739.

[14] 吳群勵(lì)，梁曉春,張宏,等.中藥筋脈通含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011，6(6):478-481.

[15] 趙麗，梁曉春,張宏,等.筋脈通含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)的Schwann 細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和NADPH氧化酶p22-phox 亞基表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2011，9(3):299-305.

[16] Musicki B,Ross AE, Champion HC,et al.Posttranslational modification of constitutive nitric oxide synthase in the penis[J].J Androl,2009,30(4):352-362.

[17] Ohmasa F,Saito M,Tsounapi P,et al.Edaravone ameliorates diabetes-Induced dysfunction of NO-induced relaxation in corpus cavernosum smooth muscle in the rat[J].The Journal of Sexual Medicine,2011,8(6):1638-1649.