神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合尼莫地平對腦缺血半暗帶細胞凋亡及凋亡蛋白Bcl-2/Bax的影響

楊慧芬,潘妍婷

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年健康雄性SD大鼠36只,體重250 g～280 g,清潔級,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。應(yīng)用線栓法經(jīng)右側(cè)頸總動脈插線建立右側(cè)大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,隨機分為模型組(n=16):缺血 2 h 再灌注 6 h、12 h、24 h、72 h 組,即刻腹腔注射等量的生理鹽水;藥物治療組(n=16):在模型組基礎(chǔ)上給予腹腔注射神經(jīng)節(jié)苷脂GM 1(申捷)3.2mg/kg、尼莫地平1.6 mg/kg)。假手術(shù)組(n=4):假手術(shù)組除不插線外,其余步驟同模型組。

1.2 標本采集 模型組及治療組動物在規(guī)定時間取材。分別于缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h取材,假手術(shù)組于手術(shù)后1 d取材。大鼠在10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉下,經(jīng)左心室插管至升主動脈,依次灌入生理鹽水200 mL、4%的多聚甲醛300 mL,灌注完畢后,斷頭取腦,自額極至枕葉分為5等份,取中間份石蠟包埋。制備厚5μ m的連續(xù)切片。

1.3 免疫組化染色 對各個組不同時間點腦組織中細胞凋亡蛋白 Bcl-2、Bax進行染色。Bcl-2、Bax蛋白檢測Ⅰ抗(兔抗大鼠 Bcl-2、BaxIgG),Ⅱ抗(生物素標記山羊抗兔IgG)。染色步驟按照免疫組化試劑盒說明進行。Bcl-2、Bax均以胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性。免疫染色陰性對照采用PBS緩沖液代替Ⅰ抗。

1.4 T UNEL細胞凋亡檢測 將石蠟包埋標本行冠狀切片,厚5 μ m,按 TUNEL試劑盒說明書進行操作。光鏡下陽性細胞核呈棕黃色。

2 結(jié) 果

2.1 凋亡相關(guān)蛋白表達 假手術(shù)組Bcl-2、Bax表達很弱。模型組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)隨再灌注時間不同,Bcl-2、Bax表達不同。Bcl-2隨著再灌注時間的延長,12 h陽性細胞數(shù)達高峰;Bax陽性細胞表達24 h達高峰。藥物治療組缺血2 h再灌注12 h Bcl-2表達明顯增多,陽性細胞計數(shù)明顯高于模型組;而Bax表達:24 h陽性細胞計數(shù)明顯低于模型組。再灌注12 h Bcl-2/Bax比值增高。詳見表1、表2。

表1 缺血區(qū)皮層凋亡細胞及Bcl-2、Bax蛋白表達動態(tài)變化(±s)

表1 缺血區(qū)皮層凋亡細胞及Bcl-2、Bax蛋白表達動態(tài)變化(±s)

組別 n 凋亡細胞計數(shù) Bcl-2 Bax假手術(shù)組 4 10.15±2.25 13.20±2.23 11.56±2.28模型組 6 h組 4 35.23±3.34 19.87±2.34 35.23±3.34 12 h組 4 48.46±2.25 27.45±3.321) 48.46±2.25 24 h組 4 57.62±2.791) 22.46±2.49 5.63±2.711)72 h組 4 52.32±3.87 17.22±2.13 49.23±2.72藥物治療組 6 h組 4 31.03±2.44 49.27±2.82 31.23±3.52 12 h組 4 40.13±2.62 42.23±3.52 36.78±2.66 24 h組 4 48.34±2.39 37.23±3.642) 40.75±2.332)72 h組 4 43.34±3.38 30.33±2.58 34.14±2.58與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05

表2 缺血再灌注不同時間Bcl-2/Bax比較(±s)

表2 缺血再灌注不同時間Bcl-2/Bax比較(±s)

組別 n 6 h 12 h 24 h 24 h藥物治療組 16 0.933±0.125 1.543±0.2361) 1.122±0.1121) 0.884±0.1341)模型組 16 0.911±0.126 1.211±0.113 0.786±0.325 0.512±0.137假手術(shù)組 4 0.921±0.132 1.033±0.224 0.968±0.313 0.911±0.248與模型組比較,1)P＜0.05

2.2 T UNEL表達 陽性細胞主要位于缺血周圍區(qū),缺血中心區(qū)未見陽性細胞表達。假手術(shù)組有弱表達,胞核染色陽性,細胞體積較小且收縮變形。模型組缺血2 h再灌注24 h陽性細胞表達達高峰;藥物治療組缺血半暗帶區(qū)TUNEL陽性細胞表達,隨再灌注時間延長,24 h達高峰,但少于模型組。

3 討 論

外源性神經(jīng)節(jié)苷脂進入血液后,與脂蛋白結(jié)合并由其運送,可通過血腦屏障嵌合于神經(jīng)細胞胞漿膜中,對神經(jīng)元細胞分化、生長、軸漿轉(zhuǎn)運和再生起著重要作用,對神經(jīng)元的損害有明顯的保護作用[1]。而尼莫地平為二氫吡啶類鈣通道阻滯劑,減少Ca2+內(nèi)流,提高缺血區(qū)局部腦血流量。氧自由基的產(chǎn)生可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[2],尼莫地平可降低腦缺血再灌注后腦組織中NO含量[3],從而減少了NO介導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用,即減少了對Bcl-2表達的損傷,從而抑制了神經(jīng)細胞凋亡,減輕缺血性損傷,起到神經(jīng)保護作用。本實驗觀察了腹腔注射神經(jīng)節(jié)苷脂GM1和尼莫地平后,發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)皮層凋亡細胞數(shù)顯著減少,與模型組對比,有統(tǒng)計學(xué)意義。藥物治療干預(yù)后,對神經(jīng)細胞可能有保護作用。

細胞凋亡的發(fā)生取決于促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白濃度。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中兩類典型的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白,發(fā)生凋亡時,Bcl-2家族蛋白通過成員間的異二聚化、磷酸化、蛋白水解等方式,最終定位于線粒體膜引起膜通透性的改變[4],并和Bax通過形成異源二聚體時,實現(xiàn)Bcl-2抑制細胞凋亡的功能。Bcl-2的這種神經(jīng)保護作用主要依賴于他對凋亡的抑制。本組試驗,假手術(shù)組皮層Bcl-2和Bax只有少量表達,而模型組缺血側(cè)皮層Bcl-2和 Bax表達明顯增多,Bcl-2蛋白在缺血早期表達明顯上調(diào),至再灌注12 h達高峰,此時,Bcl-2/Bax比值達到高峰,以后逐漸下降,表明缺血再灌注最初階段,Bcl-2蛋白發(fā)揮著細胞保護作用,但隨著時間的延續(xù),凋亡級聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn),細胞受損加重,Bcl-2蛋白降解增加,表達逐漸下降;促凋亡蛋白Bax表達在缺血在缺血早期表達逐漸上調(diào),24 h達高峰。當Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細胞凋亡,Bax通過并從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位[4]。其時間與空間的分布與T UNEL陽性神經(jīng)元一致。干預(yù)治療后腦缺血再灌注6 h～24 h,對大鼠腦組織缺血側(cè)皮層Bcl-2的促表達作用明顯增強,Bax表達明顯減少,至再灌注12 h Bcl-2/Bax比值達高峰,提示干預(yù)治療后抗凋亡的腦保護作用不僅與上調(diào)Bcl-2表達有關(guān),同時還與下調(diào)Bax表達有關(guān)。

神經(jīng)節(jié)苷脂GM1聯(lián)合尼莫地平干預(yù)治療對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)Bcl-2/Bax比值皮層凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2上調(diào)、Bax蛋白下調(diào),對缺血半暗帶細胞抗凋亡作用,可能成為挽救瀕死細胞最直接有效的方法,起到腦保護作用。

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