殼聚糖納米纖維支架對豬肝細(xì)胞分泌豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的影響

韓 冰 施曉雷 肖江強(qiáng) 張 悅 褚薛慧 顧勁揚(yáng) 顧忠澤 丁義濤*

1(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽外科，南京 210008)

2(南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床學(xué)院肝膽外科，南京 210008)

3(東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210096)

引言

雖然肝移植目前被認(rèn)為是急性肝功能衰竭和終末期肝病最有效的治療方法，但供體器官的缺乏限制了其臨床應(yīng)用［1－2］。而生物人工肝(BAL)以其獨(dú)特的生物替代作用被認(rèn)為是等待肝移植患者的一項(xiàng)有效的暫時(shí)性肝臟支持治療［3－4］。

目前，豬肝細(xì)胞因其充足的來源、方便的可獲性以及與人肝細(xì)胞相似性仍然是BAL的主要細(xì)胞來源［5－7］。然而 BAL 的臨床試驗(yàn)并不理想［4］，所以如何利用合適的支架增強(qiáng)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的功能成為目前的研究熱點(diǎn)。已有一些新型支架被報(bào)道具有增強(qiáng)肝細(xì)胞功能的作用，其中也包括本中心研發(fā)的殼聚糖納米纖維支架［8－10］。

但作為異源性細(xì)胞，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)傳播問題一直是豬肝細(xì)胞應(yīng)用中不可忽視的安全問題。PERV發(fā)現(xiàn)于1971年并隨后確認(rèn)能體外感染多種人類細(xì)胞［11］。但新型支架對豬肝細(xì)胞的 PERV分泌量和感染性的影響并無研究報(bào)道。在以前的試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)殼聚糖納米纖維支架能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞在體外的粘附性、存活性以及功能［12］。在此將進(jìn)一步研究其對肝細(xì)胞的PERV分泌量和感染性產(chǎn)生的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

體重介于15～20 kg的雜種大白豬購于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物中心。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的所有試劑均購于 GIBCO(USA)。實(shí)驗(yàn)所用殼聚糖(脫乙酰度88%)購自濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，所有材料均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖納米纖維電紡膜的制備

采用靜電紡絲的方法制備殼聚糖納米纖維電紡膜。首先制備殼聚糖溶液，溶質(zhì)為質(zhì)量比9∶1的殼聚糖與聚氧化乙烯粉末，溶劑為體積比7∶3的甲酸和無水乙醇混合液。在室溫下配備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為216%的溶液，并攪拌充分溶解。將配備好的溶液裝入20 g針頭的玻璃注射器內(nèi)，在距針頭10～20 cm處放置直徑為24 mm的蓋玻片收集紡絲。針頭與玻片之間附加115 kV/cm的電場，在微量注射泵的推動下，殼聚糖溶液被均勻地噴射到蓋玻片表面，形成殼聚糖納米纖維電紡膜(Nano組)?？瞻撞Ｆ鳛閷φ战M(Hep組)。

1.2.2 肝細(xì)胞分離、鑒定和培養(yǎng)

原代肝細(xì)胞分離采用原位兩部膠原酶灌注分離法［13-14］。首先通過門靜脈向豬肝內(nèi)灌入無 Ca2+和 Mg2+的 D-Hanks液，然后灌入 37℃ 預(yù)熱的0.05% Ⅳ型膠原酶消化45 min，過濾收集細(xì)胞并離心洗滌3次。分離的豬肝細(xì)胞活性采用臺盼藍(lán)排除法確定存活細(xì)胞大于95%。通過形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析(白蛋白及細(xì)胞角蛋白18)完成肝細(xì)胞鑒定。分離的肝細(xì)胞重懸于無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液，以106cells/mL密度接種于鋪有蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)。每日以低糖DMEM+10%FBS換液，連續(xù)7 d。每日收集的培養(yǎng)液和細(xì)胞存放于80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

將細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液離心去除其中殘留細(xì)胞及碎片，采用Trizol法(Invitrogen，US)提取總 RNA并用 DNase I(Invitrogen，U)處理，取OD 260/280介于1.6到 2.0的 RNA樣本 60 ng，用 RT試劑盒(Biouniquer，China)逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后行 PCR。其中引物為 protease特異性引物(正向5'-GCTACAACCATTAGGAAAACTAAAAG-3';反向 5'-AACCAGGACTGTATATCTTGATCAG-3')，polymerase特異性引物 (正向 5'-CTACAACCATTAG GAAAACTAAAAG-3';反向 5'-AACCAGGACTGTAT ATCTTGATCAG-3')，豬 GAPDH特異性引物(正向5'-CATCACCATCTTCCAGGAG-3';反 向 5'-TGCCCACAGCCTTGGCAGC-3')。PCR 條 件 為50℃，30 min;95℃，5 min;94℃，30 s;55℃，45 s;72℃，30 s × 35 個(gè)循環(huán)，72℃ ，5 min［15－16］。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳EB顯影。

1.2.4 PERV特異性實(shí)時(shí)定量PCR

采用Roche SuperScript III platinium系統(tǒng)和MX3000P thermocycler(Stratagene)對上述 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，其中采用PERV protease特異性基因(GenBank accession number DQ845171)和豬特異性 β-actin基 因 (GenBank accession number DQ845171)，分別設(shè)計(jì)引物 protease(正向 5'-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3';反 向 5'-AGG AAGGAGGGCTGGAAGAG-3')和 β-actin(正向 5'-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3';反 向 5'-AGGA AGGAGGGCTGGAAGAG-3')。PCR條件為95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，1 min ×40個(gè)循環(huán)，95℃，1 min;65℃，30 s;95℃，30 s。采用 protease/βactin值表作為標(biāo)準(zhǔn)化PERV RNA表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot分析

將收集細(xì)胞的裂解液進(jìn)行 Western Blot分析。一抗采用1∶1 500稀釋的與PERV gag p30蛋白交叉反應(yīng)的 mouse anti-FeLV p27抗體(ABcam，San Francisco，US)4℃孵育過夜;二抗采用 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的goat anti-mouse IgG(KeyGEN，Nanjing，China)37℃孵育 1 h。膠片曝光并用軟件ImageJ測定每條條帶的亮度。

1.2.6 體外感染實(shí)驗(yàn)

依照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液的體外感染實(shí)驗(yàn)［17－18］。首先將 HEK293細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)過夜培養(yǎng)，然后換液加入離心去除游離細(xì)胞和細(xì)胞碎片的肝細(xì)胞培養(yǎng)液及8 mg/mL聚凝胺孵育6 h。同時(shí)采用PK15上清液孵育 HEK293細(xì)胞作為陽性對照。6 h后移除孵育液并用PBS洗滌細(xì)胞兩遍，然后采用含10%FBS的DMEM-HG培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)1個(gè)月收集細(xì)胞。

1.2.7 DNA提取和PCR

采用 DNA提取試劑盒(Axygen，California，US)提取 HEK293細(xì)胞總 DNA。用人 β-actin引物(正向 5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，反向 5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3')(KeyGEN，Nanjing，China)、豬細(xì)胞色素 B((SsCytB)引物(正向 5'-CATTGGAGTAGTCCTACTATTTACCG-3'，反向5'-GTAGGATTAGTATTATAAATAAGGCTCCT-3')［19］以及上述PERV特異性protease引物和polymerase引物，PCR及結(jié)果觀測條件同上。

1.2.8 逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性測定

分別利用C型逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定試劑盒(Cavidi-Tech，Uppsala，Sweden)的定量和定性法測定肝細(xì)胞和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液的RT活性。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)均重復(fù)5次。數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用 Student t檢驗(yàn)比較兩組差異，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞上清液中的PERV RNA

RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1(a)和圖1(b)，可見兩端 PERV特異性序列protease和polymerase具有相似的變化趨勢。實(shí)時(shí)定量PCR中以protease/β-actin的比值表示標(biāo)準(zhǔn)化的PERV RNA水平，結(jié)果繪制于圖1(c)?？梢娯i肝細(xì)胞在10 h和第2 d各有一個(gè)PERV RNA分泌高峰，第2 d后逐漸下降。實(shí)驗(yàn)組和對照組于第6 d和第5 d后無PERV分泌。除第6 dPERV RNA水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余各天均無差異。

圖1 培養(yǎng)液中的PERV RNA。(a)和(b)分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組RT-PCR的結(jié)果例圖;(c)為實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果(“*”表示P＜0.05)Fig.1 PERV RNA in the supernatants.(a)and(b)the representative results of RT-PCR electrophoresis with the RNA extracted from the supernatantsin Hep group and Nano group，respectively;(c)the results of real time PCR(* P＜0.05)

2.2 PERV殼體蛋白gag p30表達(dá)水平

圖2中(a)和(b)分別表示 western blot結(jié)果樣圖以及 ImageJ軟件對條帶亮度測定的結(jié)果。和RNA分泌情況相似，gag蛋白表達(dá)在10 h和第2 d存在兩個(gè)高峰，然后呈下降趨勢。實(shí)驗(yàn)組和對照組的gag蛋白表達(dá)分別消失于第5 d和第4 d，僅第5 d兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 細(xì)胞裂解液中的PERV gag p30蛋白檢測。(a)western blot結(jié)果例圖;(b)ImageJ測量下的標(biāo)準(zhǔn)化蛋白量(“*”表示P＜0.05)Fig.2 Western blot of the PERV gag protein in the cell lysates.(a)representative results of western blot with the cell lysates in both groups;(b)the normalized protein amount in different days(*P＜0.05)

2.3 肝細(xì)胞上清液RT活性

所有培養(yǎng)液樣本的RT活性測定均重復(fù)一次，取平均值。圖3為豬肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液RT活性變化，可以看出其同樣存在10 h和第2 d的高峰，但各天的RT活性經(jīng)比較均無明顯差異。

圖3 豬肝細(xì)胞培養(yǎng)液RT活性定量測定結(jié)果Fig.3 RT activity ofthe cultured porcine hepatocytes on different substrata

2.4 HEK293細(xì)胞體外感染情況

PCR結(jié)果顯示，HEK293細(xì)胞DNA中并未發(fā)現(xiàn)PERV特異性的protease和 polymerase序列，也沒有查出豬特異性SsCytB序列(見圖4)。RT活性測定結(jié)果顯示處理后的HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)液RT活性全為陰性。

圖4 體外感染實(shí)驗(yàn)中HEK293細(xì)胞DNA PCR檢測結(jié)果例圖(C+:PK15感染的HEK293細(xì)胞;C－:純水。DNA Ladder為100～600 bp)Fig.4 Representative results of PCR electrophoresis with the DNA extracted from HEK293 cells of in vitro infection experiments(C+，PERV-infected HEK-293 cells;C-，pure water.The ladder ranged from 100 bp to 600bp.“Hep” and“Nano” meant the incubating supernatant from the simple culture of hepatocytes and the hepatocyte culture on chitosan nanofiber scaffolds)

3 討論

目前，豬肝細(xì)胞仍是生物人工肝的主要細(xì)胞來源［5－7］。目前已有一些報(bào)道就如何依靠支架提高肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的功能作出了探索［8－10］。良好的生物兼容性使殼聚糖支架收受到廣泛關(guān)注［20－21］，本研究已證實(shí)殼聚糖納米支架能夠有效地提高肝細(xì)胞的附著性、生物兼容性，以及有效改善其體外培養(yǎng)功能［10］。然而，也有學(xué)者對納米材料的安全性提出質(zhì)疑［22］，本研究從支架對病毒分泌及感染性的影響方面對其安全性進(jìn)行了研究。

1971年，Amstrong等首次從 PK15細(xì)胞中分離出 PERV［23］。1997 年，Patience發(fā)現(xiàn) PK15 細(xì)胞釋放的PERV能夠在體外感染 HEK293細(xì)胞［24］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)PERV廣泛存在于各種豬系的基因組中，而且各種豬細(xì)胞均能分泌PERV顆粒［11］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PERV可在體外感染多種人類細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞等［25－30］。Nyberg 等報(bào)道新鮮分離的豬肝細(xì)胞能夠分泌PERV，但是并不能在體外感染 HEK293細(xì)胞，而且豬肝細(xì)胞的PERV分泌量及感染性并不受肝功能肝衰竭血清影響［17］。

本研究旨在探討殼聚糖納米纖維支架對豬肝細(xì)胞PERV分泌量和感染性的影響。采用了RTPCR和RT活性測定檢測培養(yǎng)液中的PERV RNA和RT活性，western blot檢測細(xì)胞表達(dá)PERV殼體蛋白gag p30的水平。目前，RT-PCR仍然是檢測 PERV最敏感最特異的檢測方法［11］。RT活性已證明與逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒量有一定聯(lián)系［31］，本研究檢測到的低RT活性同時(shí)提示豬肝細(xì)胞釋放入上清液中的PERV顆粒較少。此外，以前的報(bào)道多是采用蔗糖密度梯度離心從培養(yǎng)液中聚集 PERV，然后通過westernblot定性檢測 PERV殼體蛋白 gag p30［32－33］。但這種濃縮的 PERV并不適用于定量或半定量分析蛋白表達(dá)量，因?yàn)樗荒軌蛲ㄟ^內(nèi)參蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。所以我們先嘗試了直接采用上清液行western blot，但是因?yàn)椴《玖刻贆z測不出。又選擇細(xì)胞裂解液作為上樣標(biāo)本以間接的檢測病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的水平，以此來反映病毒的復(fù)制水平。

本研究中，實(shí)時(shí)定量 PCR、RT活性測定和western blot結(jié)果都顯示了相似的變化趨勢，這也表明了豬肝細(xì)胞表達(dá)分泌PERV的變化。在蛋白測定中，可以看出蛋白的表達(dá)檢測不出比RNA測定提前一天，這可能是因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)量太少而western blot檢測本身的靈敏性不高所致。結(jié)果顯示PERV的表達(dá)分泌存在10 h和第2 d兩個(gè)高峰，然后逐漸下降，但在前5 d內(nèi)其RNA和RT活性均無明顯差異。結(jié)果中的第1個(gè)分泌高峰可能是新鮮分離的豬肝細(xì)胞分泌PERV以及未貼壁細(xì)胞破裂釋放PERV的結(jié)果，本研究選擇10 h作為第1個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)以此減少破裂細(xì)胞對結(jié)果產(chǎn)生的影響。而第2分泌高峰應(yīng)該是 PERV的真實(shí)分泌高峰。此外，實(shí)驗(yàn)組中PERV RNA和蛋白均比對照組遲一天消失，這說明該支架能夠延長病毒的分泌時(shí)間，這可能跟該支架能夠更好的保持細(xì)胞粘附性及活性有關(guān)［12，34］。

PERV感染性的變化是豬肝細(xì)胞應(yīng)用中最重要的問題。Nyberg等研究表明豬肝細(xì)胞釋放的PERV并不能在體外感染HEK293細(xì)胞，且這種低感染性不受肝衰血清的影響［17］。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞在經(jīng)過豬肝細(xì)胞培養(yǎng)液孵育后并未檢出PERV和SsCytB基因序列，同時(shí)RT活性也為陰性。這表明并無 HEK293細(xì)胞感染 PERV，也沒有微嵌合形式的存在。此結(jié)果顯示了殼聚糖納米纖維支架對豬肝細(xì)胞分泌的PERV的感染性并無影響。

4 結(jié)論

綜上，豬肝細(xì)胞在普通條件下可表達(dá)分泌PERV持續(xù)5 d，而在殼聚糖納米纖維支架上可延長分泌至第6 d。但是，豬肝細(xì)胞PERV的表達(dá)量和感染性并不會受殼聚糖納米纖維支架影響。該支架可安全地應(yīng)用于BAL系統(tǒng)。

［1］Lee WM，Squires RH，Jr.，Nyberg SL，et al.Acute liver failure:Summary of a workshop ［J］.Hepatology，2008，47(4):1401－1415.

［2］Riordan SM，Williams R.Perspectives on liver failure:past and future［J］.Semin Liver Dis，2008，28(2):137 －141.

［3］Gerlach JC， ZeilingerK， PatzerIiJF. Bioartificialliver systems:why，what，whither?［J］.Regen Med，2008，3(4):575－595.

［4］McKenzie TJ， Lillegard JB， Nyberg SL. Artificialand bioartificial liver support［J］.Semin Liver Dis，2008，28(2):210－217.

［5］Chamuleau RA，Deurholt T，Hoekstra R.Which are the right cells to be used in a bioartificial liver?［J］.Metab Brain Dis，2005，20(4):327－335.

［6］Tsiaoussis J，Newsome PN，Nelson LJ，et al.Which hepatocyte will it be?Hepatocyte choice for bioartificial liver support systems［J］.Liver Transpl，2001，7(1):2 －10.

［7］Kobayashi N，Okitsu T，Tanaka N.Cell choice for bioartificial livers［J］.Keio J Med，2003，52(3):151 －157.

［8］Hochleitner B，Hengster P， Bucher H， et al. Significant survival prolongation in pigs with fulminanthepatic failure treated with a novel microgravity-based bioartificial liver［J］.Artif Organs，2006，30(12):906 －914.

［9］Hochleitner B，Hengster P，Duo L，et al.A novel bioartificial liverwith culture ofporcine hepatocyte aggregates under simulated microgravity［J］.Artif Organs，2005，29(1):58 －66.

［10］褚薛慧，施曉雷，顧勁揚(yáng)，馮章啟，顧忠澤，丁義濤.殼聚糖納米纖維電紡膜體外對肝細(xì)胞作用的研究［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，29(1):144－149.

［11］Wilson CA. Porcine endogenous retroviruses and xenotransplantation［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(21):3399－3412.

［12］Chu Xuehui， Shi Xiaolei， Feng Zhangqi， et al. Chitosan nanofiber scaffold enhances hepatocyte adhesion and function［J］.Biotechnol Lett，2009，31(3):347 －352.

［13］Gu Jinyang，Shi Xiaolei，Zhang Yue，et al.Establishment of a three-dimensional co-culture system by porcine hepatocytes and bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.Hepatol Res，2009，39(4):398－407.

［14］Gu Jinyang， ShiXiaolei， ZhangYue， etal. Heterotypic interactions in the preservation of morphology and functionality of porcine hepatocytes by bone marrow mesenchymal stem cells in vitro［J］.J Cell Physiol，2009，219(1):100 － 108.

［15］Moscoso I，Hermida-Prieto M，Manez R，et al.Lack of crossspecies transmission of porcine endogenous retrovirus in pig-tobaboon xenotransplantation with sustained depletion of antialphagal antibodies［J］.Transplantation，2005，79(7):777 －782.

［16］van de Kerkhove MP， Germans MR， Deurholt T， et al.Evidence for Galalpha(1-3)Gal expression on primary porcine hepatocytes:implications for bioartificial liver systems［J］.J Hepatol，2005，42(4):541 －547.

［17］Nyberg SL，Hibbs JR，Hardin JA，et al.Influence of human fulminant hepatic failure sera on endogenous retroviral expression in pig hepatocytes［J］.Liver Transpl，2000，6(1):76 － 84.

［18］Kuddus R，Patzer JF，2nd，Lopez R，et al.Clinical and laboratory evaluation of the safety of a bioartificial liver assist device for potential transmission of porcine endogenous retrovirus［J］.Transplantation，2002，73(3):420－429.

［19］Blusch JH，Roos C，Nitschko H.A polymerase chain reactionbased protocol for the detection of transmission of pig endogenous retroviruses in pig to human xenotransplantation ［J］.Transplantation，2000，69(10):2167－2172.

［20］孔祥燁，鄭靜，王曉軍，等.殼聚糖在組織工程中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)學(xué)工程，2009，17(3):185－188.

［21］孫曉春，蔡花，許文榮，等.臍帶間質(zhì)干細(xì)胞與殼聚糖支架的生物相容性研究［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，29(3):464－467.

［22］吳秋云 唐，謝彥昕，石亞娟，楊紅.不同粒徑納米二氧化硅的體外細(xì)胞膜毒性作用［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，29(3):438－445.

［23］Armstrong JA，Porterfield JS，De Madrid AT.C-type virus particles in pig kidney cell lines ［J］.J Gen Virol，1971，10(2):195－198.

［24］Patience C，Takeuchi Y，Weiss RA.Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs［J］.Nat Med，1997，3(3):282－286.

［25］Martin U，Kiessig V，Blusch JH，et al.Expression of pig endogenous retrovirus by primary porcine endothelial cells and infection of human cells［J］.Lancet，1998，352(9129):692－694.

［26］Takeuchi Y，Patience C，Magre S，et al.Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus［J］.J Virol，1998，72(12):9986 －9991.

［27］Wilson CA，Wong S，Muller J，et al.Type C retrovirus released from porcine primary peripheral blood mononuclear cells infects human cells［J］.J Virol，1998，72(4):3082 －3087.

［28］Martin U，Winkler ME，Id M，et al.Productive infection of primary human endothelial cells by pig endogenous retrovirus(PERV)［J］.Xenotransplantation，2000，7(2):138－142.

［29］Wilson CA，Wong S，VanBrocklin M，et al.Extended analysis of the in vitro tropism of porcine endogenous retrovirus［J］.J Virol，2000，74(1):49 －56.

［30］Specke V，Rubant S，Denner J.Productive infection of human primary cells and cell lines with porcine endogenous retroviruses.Virology，2001，285(2):177－180.

［31］Pyra H，Boni J，Schupbach J.Ultrasensitive retrovirus detection by a reverse transcriptase assay based on product enhancement［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(4):1544－1548.

［32］Czauderna F，F(xiàn)ischer N，Boller K，et al.Establishment and characterization ofmolecularclonesofporcine endogenous retroviruses replicating on human cells［J］.J Virol，2000，74(9):4028－4038.

［33］Galbraith DN，Kelly HT，Dyke A，et al.Design and validation of immunological tests for the detection of Porcine endogenous retrovirus in biological materials ［J］.J Virol Methods，2000，90(2):115－124.

［34］Chu Xuihui， ShiXiaolei， FengZhangqi， etal. In vitro evaluation ofa multi-layerradial-flow bioreactorbased on galactosylated chitosan nanofiber scaffolds ［J］.Biomaterial，2009，30(27):4533－4538.