電化學(xué)實時定量PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)溫度特性研究

熊 亮 陳旭海 李玉榕 杜 民*

1(福州大學(xué)電氣工程與自動化學(xué)院，福州 350108)

2(福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室，福州 350002)

引言

聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是體外酶促合成特異 DNA片段的一種方法，由高溫變性(90～96℃)、低溫退火(25～65℃)及適溫延伸(70～75℃)三步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以按幾何級數(shù)倍增。鏈式反應(yīng)的關(guān)鍵是三溫循環(huán)的控制，要求溫度變化快、精度高、溫度均勻性與恒溫性好［1］。

電化學(xué)實時定量PCR，是一種采用電化學(xué)分析法對PCR反應(yīng)中特定DNA序列進行檢測的一種非光學(xué)實時定量PCR技術(shù)。該技術(shù)克服了目前應(yīng)用廣泛的熒光實時定量PCR技術(shù)的缺點，如光學(xué)儀器復(fù)雜、體積大、不利于小型化，通道數(shù)受光學(xué)裝置限制，需考慮儀器嚴格的蔽光性及熒光基團的特異性;同時檢測過程簡單，只需在PCR混合物中添加少量易于處理和儲存的氧化還原催化劑，就可以用電化學(xué)分析技術(shù)實現(xiàn)對較長DNA片段的檢測，且特異性強。此外，除具有實時PCR技術(shù)測量范圍寬、定量準確、精度高和速度快的優(yōu)點外，還具有可在擴增過程中進行實時定量檢測的特點(發(fā)生在電極表面)，是一種成本更低、更可靠、更易于小型化的非光學(xué)實時定量檢測技術(shù)［2］。小型化已日漸成為一種趨勢，將生物芯片應(yīng)用于實時定量PCR技術(shù)，能夠進一步縮小儀器尺寸。PCR芯片作為生物芯片的重要分支，是當(dāng)今生物芯片研究的熱點之一［3］。相對于傳統(tǒng)的 PCR擴增單元，利用 PCR芯片來實現(xiàn)DNA擴增，熱容量小，變溫迅速，試劑消耗量大大減少，設(shè)備體積小，有利于便攜式PCR的研制［4－5］。所要研究的 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)采用電化學(xué)實時定量多通道PCR芯片來作為擴增單元。

當(dāng)利用實時定量PCR進行檢測時，有許多因素影響檢測結(jié)果的準確性，其中PCR儀的溫度特性起著至關(guān)重要的作用，PCR在運行溫度上的細微差別都可能導(dǎo)致迥然不同的結(jié)果［6］。相對于傳統(tǒng) PCR擴增單元而言，PCR芯片雖因其熱容量小而變溫更迅速，但也存在一定程度的溫度熱遲滯性和不均勻性，尤其在采用電化學(xué)實時定量檢測技術(shù)的PCR芯片中，由于隔熱材料、電極布局等因素的影響，溫度熱遲滯性和不均勻性更加明顯。為了實現(xiàn)電化學(xué)多通道的實時定量測量，亦要求各孔試劑反應(yīng)條件一致、擴增速率相同，這就需要確保各孔溫度具有良好的一致性。因此，必須從熱力學(xué)的角度，對芯片整體進行優(yōu)化設(shè)計，以提升溫度控制的精度，進而提高DNA片段擴增的效率，取得更好的PCR擴增效果［7］。

筆者圍繞PCR儀工作性能對溫度特性的要求，對普通 PCR芯片［2，4］的結(jié)構(gòu)和材料進行了優(yōu)化，以改善芯片的溫度一致性與熱遲滯性，設(shè)計了一種環(huán)形、三層結(jié)構(gòu)的多通道電化學(xué)實時定量PCR芯片。利用大型有限元仿真軟件ANSYS10.0，對PCR芯片進行熱分析研究;通過穩(wěn)態(tài)分析，確定隔熱層厚度和熱補償溫度，削弱芯片與外圍空氣的對流換熱作用，以改善芯片的溫度準確性與均勻性。在穩(wěn)態(tài)分析的基礎(chǔ)上，又通過瞬態(tài)分析對芯片的溫度熱遲滯性與恒溫性進行了測試。穩(wěn)、瞬態(tài)分析結(jié)果表明，該芯片滿足PCR儀工作性能對溫度特性的要求。

1 PCR芯片結(jié)構(gòu)

圍繞PCR儀工作性能對芯片各通道溫度一致性與熱遲滯性的要求，在普通PCR芯片的基礎(chǔ)上，對芯片結(jié)構(gòu)和所用材料進行了優(yōu)化。

在傳統(tǒng)方形結(jié)構(gòu)中，邊緣孔的外部邊界條件不一致，位于4個棱角處的試劑孔相對于其他邊緣孔，具有更大的對流面積，導(dǎo)致芯片各孔溫度一致性欠佳。為使芯片外形結(jié)構(gòu)更加合理，滿足PCR儀對于溫度的一致性的要求，利用具有對稱性的環(huán)形結(jié)構(gòu)來改進該芯片。環(huán)形結(jié)構(gòu)中試劑孔完全對稱，不僅使各孔試劑反應(yīng)條件完全一致，還使各孔電極也對稱，使芯片各孔溫度的一致性從根本上得以改善。芯片內(nèi)部采用了如圖1所示的反應(yīng)池(容量為38.5 μL)內(nèi)固定式擴增結(jié)構(gòu)，分上中下3層，由下往上依次是單晶硅片、鋁片和聚碳酸酯(PC)上蓋，各層之間采用鍵合技術(shù)進行封接(見表1)［8－9］。鋁片穿有試劑孔，為了隔絕試劑與鋁材的化學(xué)作用，防止鋁片被腐蝕、試劑被污染，孔內(nèi)側(cè)表面生成有一層聚對二甲苯防護膜［10］。單晶硅片雖然具有良好的導(dǎo)熱性，但是其電絕緣性較差，因此在相應(yīng)于試劑孔的位置制作電極(電極從硅片中引出)前，需在硅與電極之間生長一層絕緣層。本研究采用的是Si3N4-SiO2雙層結(jié)構(gòu)，一薄層的氮化硅既耐腐蝕又能阻止堿金屬離子的污染，SiO2層則可以降低界面態(tài)和陷阱，解決電荷不穩(wěn)定的問題。另外，氮化硅與硅之間的二氧化硅層還可以改善氮化硅的附著能力，從而提供一個連續(xù)的界面［4］。聚碳酸酯上蓋用于對孔進行密封并留有加樣口，還起到隔熱的作用，更重要的是利用其透紅外性能，使紅外測溫能夠應(yīng)用于PCR儀中(熱像儀置于芯片正上方)。PCR儀選用半導(dǎo)體加熱制冷片(TEC)置于芯片的底面，對其進行加熱和降溫，芯片與TEC之間涂有導(dǎo)熱膠。普通PCR儀常將溫度傳感器置于樣品基座上，導(dǎo)致測量溫度和試劑溫度之間存在著時間滯后［11］。該芯片可與紅外測溫結(jié)合，能夠快速直接地測量熱源溫度(TEC上表面溫度)和試劑溫度，進而優(yōu)化控制策略，取得良好的PCR擴增效果。

表1 材料參數(shù)Tab.1 Material parameters

2 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)有限元仿真

2.1 實體建模與網(wǎng)格劃分

環(huán)形反應(yīng)池內(nèi)固定式擴增結(jié)構(gòu)實體模型如圖2所示，規(guī)格如圖1(b)所示。有限元分析過程采用3-D模型，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，節(jié)點數(shù)目巨大，分析時間長。為了保證分析的準確性及可靠性，對4種材料都使用Tet 10 Nodes 87熱分析單元，網(wǎng)格尺寸控制采用的是 Manual Size→Lines→All Lines，劃分尺寸為0.001，劃分后的網(wǎng)格如圖2所示。

2.2 穩(wěn)態(tài)分析

2.2.1 穩(wěn)態(tài)熱傳導(dǎo)方程及邊界條件

圖1 芯片結(jié)構(gòu)。(a)俯視圖;(b)縱剖視圖Fig.1 The architecture of the chip.(a)top view;(b)longitudinal section view

如果一個系統(tǒng)的凈熱流率為0，即流入系統(tǒng)的熱量Qi加上系統(tǒng)自身產(chǎn)生的熱量Qg等于流出系統(tǒng)的熱量Qo，則系統(tǒng)處于熱穩(wěn)態(tài)。在穩(wěn)態(tài)熱分析中，任意節(jié)點的溫度不隨時間變化，熱穩(wěn)態(tài)的條件為［12］

PCR儀在工作時，是將芯片溫度加熱到一個設(shè)定值，再保持這個溫度設(shè)定的時間。在芯片溫度到達設(shè)定值而進入保持階段后，芯片就達到一個穩(wěn)態(tài)傳熱的狀態(tài)［7］。由于PCR儀芯片的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且芯片沒有內(nèi)熱源，所以導(dǎo)熱問題只能用在笛卡爾坐標系中穩(wěn)態(tài)、無內(nèi)熱源條件下的導(dǎo)熱微分方程描述［7，13］，有

圖2 網(wǎng)格劃分Fig.2 The picture of mesh division

芯片穩(wěn)態(tài)熱分析的邊界條件包括:芯片底面的第一類邊界條件、芯片其余表面對流換熱的第三類邊界條件。芯片底面與產(chǎn)熱率相同的半導(dǎo)體加熱制冷片接觸，當(dāng)加熱到溫度設(shè)定值時，芯片底面與半導(dǎo)體加熱制冷片的接觸面保持恒定溫度。由于熱源溫度tw=94℃時各表面的對流換熱系數(shù)最大，對芯片溫度準確性與均勻性的影響最明顯，所以只分析芯片在該溫度時的溫度場［7］。

芯片除底面加有熱源外，其余表面與空氣都存在自然對流，這是影響芯片溫度準確性與均勻性的一個重要因素，應(yīng)該盡可能地削弱對流換熱所帶來的不利影響。當(dāng)芯片厚度面積比很小時，由側(cè)面空氣對流損失的熱量幾乎可以忽略不計。而對芯片溫度準確性與均勻性產(chǎn)生最大影響的當(dāng)屬來自于上表面的空氣對流散熱，這屬于水平壁面熱面向上的自然對流換熱問題。對于空氣對流換熱引起的溫度場溫差，由牛頓對流換熱冷卻公式Φ=hA(tw-tf)可知，在接觸面積A、熱端溫度 tw不變的前提下，芯片單位時間內(nèi)通過空氣對流換熱損失的熱量Φ完全由對流換熱系數(shù)h和環(huán)境空氣溫度tf決定。如果要減小空氣對流換熱對溫度準確性與均勻性的影響，就必須減小hw或者增大tf。

在室溫(20℃)下，當(dāng)上表面對流換熱系數(shù)值為11.84 W/m2·K、側(cè)壁對流換熱系數(shù)值為20.58 W/m2·K時，芯片各孔的試劑溫度分布如圖3所示。此時，芯片的溫度準確性與均勻性誤差分別為1.061℃和1.06℃，不能滿足PCR儀工作性能的要求。不過，由于芯片采用了環(huán)形結(jié)構(gòu)，各孔的溫度一致性誤差為0℃。

2.2.2 改進措施

圖3 改進前芯片中的試劑溫度分布Fig.3 The picture of reagent’s temperature distribution before the improvement of the chip

由于隔熱和熱補償都有利于減少芯片與空氣對流換熱而損失的熱量Φ，因此采用兩者相結(jié)合的措施來改善熱循環(huán)系統(tǒng)。首先，通過仿真分析確定有限元模型的隔熱層厚度，即特征尺度 lc;然后，在隔熱仿真分析結(jié)果的基礎(chǔ)之上對空氣施加熱補償，即提高周圍空氣溫度tf，進而分析確定熱補償溫度。

在隔熱仿真分析中，室溫下側(cè)壁隔熱層取38 mm為最佳厚度(即上表面lc值為118 mm)，該厚度是層流轉(zhuǎn)換為湍流的一個邊界厚度［13］，這時上表面對流換熱系數(shù)值最小約為9.07 W/m2·K。在此基礎(chǔ)上，再對芯片進行熱分析，以確定上蓋厚度。

2.3 瞬態(tài)分析

瞬態(tài)傳熱過程，是指一個系統(tǒng)的加熱或冷卻的過程。在這個過程中，系統(tǒng)的溫度、熱流率、熱邊界條件以及系統(tǒng)內(nèi)能隨時間都有明顯變化。瞬態(tài)傳熱分析的基本步驟與穩(wěn)態(tài)熱分析類似，不同的是瞬態(tài)熱分析中的載荷是隨時間變化的［12］。為了測試改善后的PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)中芯片反應(yīng)池的熱遲滯性和恒溫性，特設(shè)定一組工作參數(shù)對其性能進行了測試。測試時在芯片中選擇了一個測試孔，并以孔中軸線上中心節(jié)點及下端點作為具體測試點。設(shè)定的3個溫度點分別為 94、55和 72℃，在3個溫度點停留的時間分別為 60、60和120 s。

3 結(jié)果

3.1 穩(wěn)態(tài)分析結(jié)果

芯片隔熱仿真分析結(jié)果如圖4所示，溫度準確性誤差值與溫度均勻性誤差值僅相差0.001℃，溫度準確性誤差曲線與溫度均勻性誤差曲線幾乎完全重合。當(dāng)上蓋厚度在0.05～3 mm的范圍之內(nèi)時，溫度準確性誤差與溫度均勻性誤差在0.74～0.85℃之間;在最佳狀態(tài)(上蓋取1.5 mm，即側(cè)壁lc值為2.925 mm)時，溫度準確性誤差和均勻性誤差分別為0.741和0.74℃，芯片溫度特性得到一定的改善，但試劑中央溫度仍達不到實驗的要求?？梢?，單獨采用隔熱措施雖能夠部分改善芯片的溫度準確性與均勻性，但不能很好地滿足 PCR擴增的要求。

圖4 上蓋隔熱仿真結(jié)果Fig.4 Simulation result for the top cover’s heat insulation measure

在添加隔熱層仿真結(jié)果的基礎(chǔ)上，考慮到芯片的溫度特性、制作的工藝條件及后續(xù)PCR儀研發(fā)中紅外測溫的應(yīng)用，芯片上蓋和側(cè)壁分別取0.05和38 mm厚的聚碳酸酯隔熱層。采取隔熱和熱補償相結(jié)合的改進措施時，其有限元仿真結(jié)果如圖5所示。當(dāng)熱補償溫度處于70～100℃時，溫度準確性與均勻性誤差都小于0.2℃，能夠滿足PCR擴增的要求。當(dāng)tf=70℃時，試劑溫度分布如圖5(b)所示，溫度一致性誤差為0℃，溫度準確性與均勻性誤差同為0.176℃?？梢?，采取隔熱和熱補償相結(jié)合的改進措施，明顯改善了芯片的溫度準確性與均勻性。

3.2 瞬態(tài)分析結(jié)果

圖6為芯片在 tf=70℃，溫度循環(huán)歷時4 min時，試劑的溫度循環(huán)特性曲線?？梢?，升降溫速率分別為4和3℃/s，能夠滿足 PCR儀工作性能的要求。

4 討論

在穩(wěn)態(tài)分析中，隔熱仿真結(jié)果表明，隔熱層的添加能夠部分改善芯片的溫度準確性與均勻性。當(dāng)上蓋厚度在0.05～3 mm的范圍之內(nèi)時，溫度準確性誤差與溫度均勻性誤差在0.74～0.85℃之間，最小誤差分別為0.741和0.74℃，仍達不到PCR擴增的要求。這主要是因為隔熱層不僅起到隔熱的作用，還是熱負載;當(dāng)其厚度大到一定程度時，將對芯片溫度準確性與均勻性起到主要影響作用。芯片由于尺寸太小、厚度面積比偏大，導(dǎo)致上表面對流散熱過多(研究發(fā)現(xiàn)下表面對流影響不大，可忽略);而上表面隔熱層的添加雖有助于側(cè)壁對流系數(shù)的減小，但同時也成為芯片的熱負載，使整體熱阻增大。

圖5 隔熱層確定后添加熱補償措施。(a)隔熱層確定后的熱補償措施仿真結(jié)果;(b)tf=70℃時的試劑溫度分布Fig.5 The thermal compensation measure after the confirmation of the heat insulation.(a)simulation result for the thermal compensation measure after the confirmation of the heat insulation;(b)the picture of reagent’s temperature distribution at tf=70℃

圖6 tf=70℃時的節(jié)點溫度變化Fig.6 The picture of nodes’changing temperature at tf=70℃

溫度場的仿真結(jié)果表明，隔熱和熱補償相結(jié)合的改進措施明顯改善了芯片的溫度準確性與均勻性。當(dāng)熱端溫度取94℃時，在上蓋和側(cè)壁分別添加0.05和38 mm厚的聚碳酸酯隔熱層。在熱補償溫度處于70～94℃時，芯片的溫度準確性、均勻性誤差與熱補償溫度值基本呈線性遞減的變化趨勢，都小于0.2℃;在熱補償溫度處于94～100℃時，芯片的溫度準確性、均勻性誤差雖也小于0.2℃，但是溫度誤差曲線呈上升趨勢。此外，芯片由于采用了環(huán)形結(jié)構(gòu)，其各孔的溫度一致性誤差為0℃，該熱循環(huán)系統(tǒng)能夠滿足PCR儀工作性能對溫度一致性、溫度準確性與均勻性的要求。PCR儀工作時，應(yīng)使熱補償溫度盡量與加熱溫度相當(dāng)，這樣對流不明顯，起主要熱交換作用的是熱傳導(dǎo)［13］，而空氣的導(dǎo)熱系數(shù)又非常低，因此能夠極大地削弱上表面的對流散熱能力。熱補償溫度的確定，還應(yīng)考慮下階段鏈式反應(yīng)的溫度控制問題。

瞬態(tài)分析關(guān)于改善后的PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)溫度場動態(tài)分布仿真結(jié)果表明，該芯片反應(yīng)池的熱遲滯性與恒溫性滿足PCR儀工作性能的要求。在tf=70℃、溫度循環(huán)歷時4 min時，試劑升降溫速度分別為4和3℃/s。

5 結(jié)論

本研究圍繞PCR儀工作性能對溫度特性的要求，對普通PCR芯片的結(jié)構(gòu)和材料進行了優(yōu)化，以改善芯片的溫度一致性與熱遲滯性，設(shè)計了一種環(huán)形、3層結(jié)構(gòu)的電化學(xué)實時定量多通道 PCR芯片。利用大型有限元仿真軟件ANSYS10.0，對PCR芯片進行熱分析研究，穩(wěn)態(tài)分析確定了隔熱層厚度和熱補償溫度來削弱芯片與外圍空氣的對流換熱作用，以改善芯片的溫度準確性與均勻性。在穩(wěn)態(tài)分析結(jié)果的基礎(chǔ)之上，又通過瞬態(tài)分析對芯片的溫度熱遲滯性與恒溫性進行了測試。穩(wěn)、瞬態(tài)分析結(jié)果證明，改善后的熱循環(huán)系統(tǒng)溫度特性能夠滿足PCR儀工作性能的要求。本研究為開發(fā)實時定量的PCR儀提供了一定的理論支持。

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