• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    電化學(xué)實時定量PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)溫度特性研究

    2011-11-27 04:47:32陳旭海李玉榕
    關(guān)鍵詞:隔熱層對流穩(wěn)態(tài)

    熊 亮 陳旭海 李玉榕 杜 民*

    1(福州大學(xué)電氣工程與自動化學(xué)院,福州 350108)

    2(福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室,福州 350002)

    引言

    聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是體外酶促合成特異 DNA片段的一種方法,由高溫變性(90~96℃)、低溫退火(25~65℃)及適溫延伸(70~75℃)三步反應(yīng)組成一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以按幾何級數(shù)倍增。鏈式反應(yīng)的關(guān)鍵是三溫循環(huán)的控制,要求溫度變化快、精度高、溫度均勻性與恒溫性好[1]。

    電化學(xué)實時定量PCR,是一種采用電化學(xué)分析法對PCR反應(yīng)中特定DNA序列進行檢測的一種非光學(xué)實時定量PCR技術(shù)。該技術(shù)克服了目前應(yīng)用廣泛的熒光實時定量PCR技術(shù)的缺點,如光學(xué)儀器復(fù)雜、體積大、不利于小型化,通道數(shù)受光學(xué)裝置限制,需考慮儀器嚴格的蔽光性及熒光基團的特異性;同時檢測過程簡單,只需在PCR混合物中添加少量易于處理和儲存的氧化還原催化劑,就可以用電化學(xué)分析技術(shù)實現(xiàn)對較長DNA片段的檢測,且特異性強。此外,除具有實時PCR技術(shù)測量范圍寬、定量準確、精度高和速度快的優(yōu)點外,還具有可在擴增過程中進行實時定量檢測的特點(發(fā)生在電極表面),是一種成本更低、更可靠、更易于小型化的非光學(xué)實時定量檢測技術(shù)[2]。小型化已日漸成為一種趨勢,將生物芯片應(yīng)用于實時定量PCR技術(shù),能夠進一步縮小儀器尺寸。PCR芯片作為生物芯片的重要分支,是當(dāng)今生物芯片研究的熱點之一[3]。相對于傳統(tǒng)的 PCR擴增單元,利用 PCR芯片來實現(xiàn)DNA擴增,熱容量小,變溫迅速,試劑消耗量大大減少,設(shè)備體積小,有利于便攜式PCR的研制[4-5]。所要研究的 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)采用電化學(xué)實時定量多通道PCR芯片來作為擴增單元。

    當(dāng)利用實時定量PCR進行檢測時,有許多因素影響檢測結(jié)果的準確性,其中PCR儀的溫度特性起著至關(guān)重要的作用,PCR在運行溫度上的細微差別都可能導(dǎo)致迥然不同的結(jié)果[6]。相對于傳統(tǒng) PCR擴增單元而言,PCR芯片雖因其熱容量小而變溫更迅速,但也存在一定程度的溫度熱遲滯性和不均勻性,尤其在采用電化學(xué)實時定量檢測技術(shù)的PCR芯片中,由于隔熱材料、電極布局等因素的影響,溫度熱遲滯性和不均勻性更加明顯。為了實現(xiàn)電化學(xué)多通道的實時定量測量,亦要求各孔試劑反應(yīng)條件一致、擴增速率相同,這就需要確保各孔溫度具有良好的一致性。因此,必須從熱力學(xué)的角度,對芯片整體進行優(yōu)化設(shè)計,以提升溫度控制的精度,進而提高DNA片段擴增的效率,取得更好的PCR擴增效果[7]。

    筆者圍繞PCR儀工作性能對溫度特性的要求,對普通 PCR芯片[2,4]的結(jié)構(gòu)和材料進行了優(yōu)化,以改善芯片的溫度一致性與熱遲滯性,設(shè)計了一種環(huán)形、三層結(jié)構(gòu)的多通道電化學(xué)實時定量PCR芯片。利用大型有限元仿真軟件ANSYS10.0,對PCR芯片進行熱分析研究;通過穩(wěn)態(tài)分析,確定隔熱層厚度和熱補償溫度,削弱芯片與外圍空氣的對流換熱作用,以改善芯片的溫度準確性與均勻性。在穩(wěn)態(tài)分析的基礎(chǔ)上,又通過瞬態(tài)分析對芯片的溫度熱遲滯性與恒溫性進行了測試。穩(wěn)、瞬態(tài)分析結(jié)果表明,該芯片滿足PCR儀工作性能對溫度特性的要求。

    1 PCR芯片結(jié)構(gòu)

    圍繞PCR儀工作性能對芯片各通道溫度一致性與熱遲滯性的要求,在普通PCR芯片的基礎(chǔ)上,對芯片結(jié)構(gòu)和所用材料進行了優(yōu)化。

    在傳統(tǒng)方形結(jié)構(gòu)中,邊緣孔的外部邊界條件不一致,位于4個棱角處的試劑孔相對于其他邊緣孔,具有更大的對流面積,導(dǎo)致芯片各孔溫度一致性欠佳。為使芯片外形結(jié)構(gòu)更加合理,滿足PCR儀對于溫度的一致性的要求,利用具有對稱性的環(huán)形結(jié)構(gòu)來改進該芯片。環(huán)形結(jié)構(gòu)中試劑孔完全對稱,不僅使各孔試劑反應(yīng)條件完全一致,還使各孔電極也對稱,使芯片各孔溫度的一致性從根本上得以改善。芯片內(nèi)部采用了如圖1所示的反應(yīng)池(容量為38.5 μL)內(nèi)固定式擴增結(jié)構(gòu),分上中下3層,由下往上依次是單晶硅片、鋁片和聚碳酸酯(PC)上蓋,各層之間采用鍵合技術(shù)進行封接(見表1)[8-9]。鋁片穿有試劑孔,為了隔絕試劑與鋁材的化學(xué)作用,防止鋁片被腐蝕、試劑被污染,孔內(nèi)側(cè)表面生成有一層聚對二甲苯防護膜[10]。單晶硅片雖然具有良好的導(dǎo)熱性,但是其電絕緣性較差,因此在相應(yīng)于試劑孔的位置制作電極(電極從硅片中引出)前,需在硅與電極之間生長一層絕緣層。本研究采用的是Si3N4-SiO2雙層結(jié)構(gòu),一薄層的氮化硅既耐腐蝕又能阻止堿金屬離子的污染,SiO2層則可以降低界面態(tài)和陷阱,解決電荷不穩(wěn)定的問題。另外,氮化硅與硅之間的二氧化硅層還可以改善氮化硅的附著能力,從而提供一個連續(xù)的界面[4]。聚碳酸酯上蓋用于對孔進行密封并留有加樣口,還起到隔熱的作用,更重要的是利用其透紅外性能,使紅外測溫能夠應(yīng)用于PCR儀中(熱像儀置于芯片正上方)。PCR儀選用半導(dǎo)體加熱制冷片(TEC)置于芯片的底面,對其進行加熱和降溫,芯片與TEC之間涂有導(dǎo)熱膠。普通PCR儀常將溫度傳感器置于樣品基座上,導(dǎo)致測量溫度和試劑溫度之間存在著時間滯后[11]。該芯片可與紅外測溫結(jié)合,能夠快速直接地測量熱源溫度(TEC上表面溫度)和試劑溫度,進而優(yōu)化控制策略,取得良好的PCR擴增效果。

    表1 材料參數(shù)Tab.1 Material parameters

    2 PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)有限元仿真

    2.1 實體建模與網(wǎng)格劃分

    環(huán)形反應(yīng)池內(nèi)固定式擴增結(jié)構(gòu)實體模型如圖2所示,規(guī)格如圖1(b)所示。有限元分析過程采用3-D模型,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,節(jié)點數(shù)目巨大,分析時間長。為了保證分析的準確性及可靠性,對4種材料都使用Tet 10 Nodes 87熱分析單元,網(wǎng)格尺寸控制采用的是 Manual Size→Lines→All Lines,劃分尺寸為0.001,劃分后的網(wǎng)格如圖2所示。

    2.2 穩(wěn)態(tài)分析

    2.2.1 穩(wěn)態(tài)熱傳導(dǎo)方程及邊界條件

    圖1 芯片結(jié)構(gòu)。(a)俯視圖;(b)縱剖視圖Fig.1 The architecture of the chip.(a)top view;(b)longitudinal section view

    如果一個系統(tǒng)的凈熱流率為0,即流入系統(tǒng)的熱量Qi加上系統(tǒng)自身產(chǎn)生的熱量Qg等于流出系統(tǒng)的熱量Qo,則系統(tǒng)處于熱穩(wěn)態(tài)。在穩(wěn)態(tài)熱分析中,任意節(jié)點的溫度不隨時間變化,熱穩(wěn)態(tài)的條件為[12]

    PCR儀在工作時,是將芯片溫度加熱到一個設(shè)定值,再保持這個溫度設(shè)定的時間。在芯片溫度到達設(shè)定值而進入保持階段后,芯片就達到一個穩(wěn)態(tài)傳熱的狀態(tài)[7]。由于PCR儀芯片的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,而且芯片沒有內(nèi)熱源,所以導(dǎo)熱問題只能用在笛卡爾坐標系中穩(wěn)態(tài)、無內(nèi)熱源條件下的導(dǎo)熱微分方程描述[7,13],有

    圖2 網(wǎng)格劃分Fig.2 The picture of mesh division

    芯片穩(wěn)態(tài)熱分析的邊界條件包括:芯片底面的第一類邊界條件、芯片其余表面對流換熱的第三類邊界條件。芯片底面與產(chǎn)熱率相同的半導(dǎo)體加熱制冷片接觸,當(dāng)加熱到溫度設(shè)定值時,芯片底面與半導(dǎo)體加熱制冷片的接觸面保持恒定溫度。由于熱源溫度tw=94℃時各表面的對流換熱系數(shù)最大,對芯片溫度準確性與均勻性的影響最明顯,所以只分析芯片在該溫度時的溫度場[7]。

    芯片除底面加有熱源外,其余表面與空氣都存在自然對流,這是影響芯片溫度準確性與均勻性的一個重要因素,應(yīng)該盡可能地削弱對流換熱所帶來的不利影響。當(dāng)芯片厚度面積比很小時,由側(cè)面空氣對流損失的熱量幾乎可以忽略不計。而對芯片溫度準確性與均勻性產(chǎn)生最大影響的當(dāng)屬來自于上表面的空氣對流散熱,這屬于水平壁面熱面向上的自然對流換熱問題。對于空氣對流換熱引起的溫度場溫差,由牛頓對流換熱冷卻公式Φ=hA(tw-tf)可知,在接觸面積A、熱端溫度 tw不變的前提下,芯片單位時間內(nèi)通過空氣對流換熱損失的熱量Φ完全由對流換熱系數(shù)h和環(huán)境空氣溫度tf決定。如果要減小空氣對流換熱對溫度準確性與均勻性的影響,就必須減小hw或者增大tf。

    在室溫(20℃)下,當(dāng)上表面對流換熱系數(shù)值為11.84 W/m2·K、側(cè)壁對流換熱系數(shù)值為20.58 W/m2·K時,芯片各孔的試劑溫度分布如圖3所示。此時,芯片的溫度準確性與均勻性誤差分別為1.061℃和1.06℃,不能滿足PCR儀工作性能的要求。不過,由于芯片采用了環(huán)形結(jié)構(gòu),各孔的溫度一致性誤差為0℃。

    2.2.2 改進措施

    圖3 改進前芯片中的試劑溫度分布Fig.3 The picture of reagent’s temperature distribution before the improvement of the chip

    由于隔熱和熱補償都有利于減少芯片與空氣對流換熱而損失的熱量Φ,因此采用兩者相結(jié)合的措施來改善熱循環(huán)系統(tǒng)。首先,通過仿真分析確定有限元模型的隔熱層厚度,即特征尺度 lc;然后,在隔熱仿真分析結(jié)果的基礎(chǔ)之上對空氣施加熱補償,即提高周圍空氣溫度tf,進而分析確定熱補償溫度。

    在隔熱仿真分析中,室溫下側(cè)壁隔熱層取38 mm為最佳厚度(即上表面lc值為118 mm),該厚度是層流轉(zhuǎn)換為湍流的一個邊界厚度[13],這時上表面對流換熱系數(shù)值最小約為9.07 W/m2·K。在此基礎(chǔ)上,再對芯片進行熱分析,以確定上蓋厚度。

    2.3 瞬態(tài)分析

    瞬態(tài)傳熱過程,是指一個系統(tǒng)的加熱或冷卻的過程。在這個過程中,系統(tǒng)的溫度、熱流率、熱邊界條件以及系統(tǒng)內(nèi)能隨時間都有明顯變化。瞬態(tài)傳熱分析的基本步驟與穩(wěn)態(tài)熱分析類似,不同的是瞬態(tài)熱分析中的載荷是隨時間變化的[12]。為了測試改善后的PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)中芯片反應(yīng)池的熱遲滯性和恒溫性,特設(shè)定一組工作參數(shù)對其性能進行了測試。測試時在芯片中選擇了一個測試孔,并以孔中軸線上中心節(jié)點及下端點作為具體測試點。設(shè)定的3個溫度點分別為 94、55和 72℃,在3個溫度點停留的時間分別為 60、60和120 s。

    3 結(jié)果

    3.1 穩(wěn)態(tài)分析結(jié)果

    芯片隔熱仿真分析結(jié)果如圖4所示,溫度準確性誤差值與溫度均勻性誤差值僅相差0.001℃,溫度準確性誤差曲線與溫度均勻性誤差曲線幾乎完全重合。當(dāng)上蓋厚度在0.05~3 mm的范圍之內(nèi)時,溫度準確性誤差與溫度均勻性誤差在0.74~0.85℃之間;在最佳狀態(tài)(上蓋取1.5 mm,即側(cè)壁lc值為2.925 mm)時,溫度準確性誤差和均勻性誤差分別為0.741和0.74℃,芯片溫度特性得到一定的改善,但試劑中央溫度仍達不到實驗的要求??梢?,單獨采用隔熱措施雖能夠部分改善芯片的溫度準確性與均勻性,但不能很好地滿足 PCR擴增的要求。

    圖4 上蓋隔熱仿真結(jié)果Fig.4 Simulation result for the top cover’s heat insulation measure

    在添加隔熱層仿真結(jié)果的基礎(chǔ)上,考慮到芯片的溫度特性、制作的工藝條件及后續(xù)PCR儀研發(fā)中紅外測溫的應(yīng)用,芯片上蓋和側(cè)壁分別取0.05和38 mm厚的聚碳酸酯隔熱層。采取隔熱和熱補償相結(jié)合的改進措施時,其有限元仿真結(jié)果如圖5所示。當(dāng)熱補償溫度處于70~100℃時,溫度準確性與均勻性誤差都小于0.2℃,能夠滿足PCR擴增的要求。當(dāng)tf=70℃時,試劑溫度分布如圖5(b)所示,溫度一致性誤差為0℃,溫度準確性與均勻性誤差同為0.176℃??梢?,采取隔熱和熱補償相結(jié)合的改進措施,明顯改善了芯片的溫度準確性與均勻性。

    3.2 瞬態(tài)分析結(jié)果

    圖6為芯片在 tf=70℃,溫度循環(huán)歷時4 min時,試劑的溫度循環(huán)特性曲線??梢?,升降溫速率分別為4和3℃/s,能夠滿足 PCR儀工作性能的要求。

    4 討論

    在穩(wěn)態(tài)分析中,隔熱仿真結(jié)果表明,隔熱層的添加能夠部分改善芯片的溫度準確性與均勻性。當(dāng)上蓋厚度在0.05~3 mm的范圍之內(nèi)時,溫度準確性誤差與溫度均勻性誤差在0.74~0.85℃之間,最小誤差分別為0.741和0.74℃,仍達不到PCR擴增的要求。這主要是因為隔熱層不僅起到隔熱的作用,還是熱負載;當(dāng)其厚度大到一定程度時,將對芯片溫度準確性與均勻性起到主要影響作用。芯片由于尺寸太小、厚度面積比偏大,導(dǎo)致上表面對流散熱過多(研究發(fā)現(xiàn)下表面對流影響不大,可忽略);而上表面隔熱層的添加雖有助于側(cè)壁對流系數(shù)的減小,但同時也成為芯片的熱負載,使整體熱阻增大。

    圖5 隔熱層確定后添加熱補償措施。(a)隔熱層確定后的熱補償措施仿真結(jié)果;(b)tf=70℃時的試劑溫度分布Fig.5 The thermal compensation measure after the confirmation of the heat insulation.(a)simulation result for the thermal compensation measure after the confirmation of the heat insulation;(b)the picture of reagent’s temperature distribution at tf=70℃

    圖6 tf=70℃時的節(jié)點溫度變化Fig.6 The picture of nodes’changing temperature at tf=70℃

    溫度場的仿真結(jié)果表明,隔熱和熱補償相結(jié)合的改進措施明顯改善了芯片的溫度準確性與均勻性。當(dāng)熱端溫度取94℃時,在上蓋和側(cè)壁分別添加0.05和38 mm厚的聚碳酸酯隔熱層。在熱補償溫度處于70~94℃時,芯片的溫度準確性、均勻性誤差與熱補償溫度值基本呈線性遞減的變化趨勢,都小于0.2℃;在熱補償溫度處于94~100℃時,芯片的溫度準確性、均勻性誤差雖也小于0.2℃,但是溫度誤差曲線呈上升趨勢。此外,芯片由于采用了環(huán)形結(jié)構(gòu),其各孔的溫度一致性誤差為0℃,該熱循環(huán)系統(tǒng)能夠滿足PCR儀工作性能對溫度一致性、溫度準確性與均勻性的要求。PCR儀工作時,應(yīng)使熱補償溫度盡量與加熱溫度相當(dāng),這樣對流不明顯,起主要熱交換作用的是熱傳導(dǎo)[13],而空氣的導(dǎo)熱系數(shù)又非常低,因此能夠極大地削弱上表面的對流散熱能力。熱補償溫度的確定,還應(yīng)考慮下階段鏈式反應(yīng)的溫度控制問題。

    瞬態(tài)分析關(guān)于改善后的PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)溫度場動態(tài)分布仿真結(jié)果表明,該芯片反應(yīng)池的熱遲滯性與恒溫性滿足PCR儀工作性能的要求。在tf=70℃、溫度循環(huán)歷時4 min時,試劑升降溫速度分別為4和3℃/s。

    5 結(jié)論

    本研究圍繞PCR儀工作性能對溫度特性的要求,對普通PCR芯片的結(jié)構(gòu)和材料進行了優(yōu)化,以改善芯片的溫度一致性與熱遲滯性,設(shè)計了一種環(huán)形、3層結(jié)構(gòu)的電化學(xué)實時定量多通道 PCR芯片。利用大型有限元仿真軟件ANSYS10.0,對PCR芯片進行熱分析研究,穩(wěn)態(tài)分析確定了隔熱層厚度和熱補償溫度來削弱芯片與外圍空氣的對流換熱作用,以改善芯片的溫度準確性與均勻性。在穩(wěn)態(tài)分析結(jié)果的基礎(chǔ)之上,又通過瞬態(tài)分析對芯片的溫度熱遲滯性與恒溫性進行了測試。穩(wěn)、瞬態(tài)分析結(jié)果證明,改善后的熱循環(huán)系統(tǒng)溫度特性能夠滿足PCR儀工作性能的要求。本研究為開發(fā)實時定量的PCR儀提供了一定的理論支持。

    [1]胡林艷,唐小萍 用DSP控制單元實現(xiàn)PCR溫度控制的方法[J].微納電子技術(shù),2004,8:45-47.

    [2]ThibautD,MichelD,Murielle RD,etal. Real-time electrochemical monitoring of the polymerase chain reaction by mediated redox catalysis[J].Journal of the American Chemical Society.2009,131(32):11433 -11441.

    [3]Yeung SSW,Lee TMH,Hsing IM.Electrochemistry-based realtime pcr on a microchip[J].Analytical Chemistry.2008,80(2):363-368.

    [4]劉大震,閆衛(wèi)平.硅基單反應(yīng)腔PCR生物芯片的設(shè)計與制作[D].大連:大連理工大學(xué),2004.

    [5]Fang TH,Ramalingam N,Dong XD,et al.Real-time pcr microfluidic devices with concurrent electrochemical detection[J].Biosensors and Bioelectronics.2009,24(7):2131 - 2136.

    [6]程遠霞,魏燕,魯祥友,等.PCR溫度特性實驗研究與分析[J].生命醫(yī)學(xué)儀器,2008,6(6):52 -56.

    [7]陳世澤,陳章位,黃靖,等.PCR儀溫度控制均勻性研究與仿真分析[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報,2009,28(4):610-614.

    [8]章春筍,徐進良.連續(xù)流動式 PCR芯片相關(guān)技術(shù)研究進展[J].分析測試學(xué)報,2004,23(6):114 -118.

    [9]劉大震,閆衛(wèi)平,郭吉洪,等.PCR生物芯片微反應(yīng)腔的制作及其熱分析[J].微納電子技術(shù),2003,40(7):321-323.

    [10]Shin YS,Cho K,Lim SH,et al.Pdms-based mirco pcr chip with parylene coating[J]. JournalofMic-romechanics and Microengineering.2003,13(5):768 -774.

    [11]Huang Jingchen,Zhang Wei,Yao Yinghao,et al.Simulation and experimental study of temprature lag time for polymerase chain reaction instrument[C]//Proceedings of the 3rd International Conference on Biomedical Engineering and Informatics.Yantai:IEEE,2010:1591-1594.

    [12]張朝暉.ANSYS 8.0熱分析教程與實例解析[M]. 北京:中國鐵道出版社,2005.

    [13]戴鍋生.傳熱學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2003.

    猜你喜歡
    隔熱層對流穩(wěn)態(tài)
    基于多尺度熱傳導(dǎo)分析的建筑隔熱層節(jié)能設(shè)計優(yōu)化
    齊口裂腹魚集群行為對流態(tài)的響應(yīng)
    可變速抽水蓄能機組穩(wěn)態(tài)運行特性研究
    碳化硅復(fù)合包殼穩(wěn)態(tài)應(yīng)力與失效概率分析
    低溫通風(fēng)環(huán)境下高溫隧道溫度場和應(yīng)力場的演化規(guī)律研究
    電廠熱力系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)仿真軟件開發(fā)
    煤氣與熱力(2021年4期)2021-06-09 06:16:54
    元中期歷史劇對社會穩(wěn)態(tài)的皈依與維護
    中華戲曲(2020年1期)2020-02-12 02:28:18
    高溫?zé)岷λ矶礈囟葓鲇嬎慵案魺釋舆x取原則
    低密度發(fā)泡水泥隔熱層施工方法探討
    基于ANSYS的自然對流換熱系數(shù)計算方法研究
    国产精品日韩av在线免费观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 波多野结衣巨乳人妻| 韩国av在线不卡| 春色校园在线视频观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 真人做人爱边吃奶动态| 特级一级黄色大片| 久久热精品热| av免费在线看不卡| av视频在线观看入口| 秋霞在线观看毛片| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产熟女欧美一区二区| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品女同一区二区软件| 国产麻豆成人av免费视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产 一区精品| 亚洲精品国产成人久久av| 精品一区二区三区视频在线| 级片在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美精品v在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 男人和女人高潮做爰伦理| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久人人精品亚洲av| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品久久视频播放| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 最好的美女福利视频网| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品人妻久久久久久| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品夜色国产| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久久午夜电影| 亚洲av.av天堂| 亚洲美女黄片视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 三级国产精品欧美在线观看| 最近在线观看免费完整版| eeuss影院久久| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲综合色惰| 免费在线观看影片大全网站| 97碰自拍视频| 亚洲精品成人久久久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 色哟哟哟哟哟哟| 国产三级在线视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品午夜福利在线看| 淫秽高清视频在线观看| 嫩草影院入口| 能在线免费观看的黄片| 免费黄网站久久成人精品| av专区在线播放| 天天一区二区日本电影三级| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国内精品美女久久久久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲成人av在线免费| 波多野结衣高清无吗| 精品人妻视频免费看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲熟妇熟女久久| 麻豆国产97在线/欧美| 床上黄色一级片| 深爱激情五月婷婷| 国产一区二区在线av高清观看| 免费av毛片视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产黄色小视频在线观看| 嫩草影院入口| 国产精品久久久久久av不卡| 国产亚洲91精品色在线| 国产av在哪里看| 色在线成人网| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品久久久久久久电影| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲性久久影院| 天堂网av新在线| 男女那种视频在线观看| 国产综合懂色| 内射极品少妇av片p| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日本爱情动作片www.在线观看 | eeuss影院久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| 国产探花极品一区二区| 国产精品野战在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜福利18| av国产免费在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 男人的好看免费观看在线视频| 免费搜索国产男女视频| 国产成人影院久久av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久久伊人网av| 一本一本综合久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 成人性生交大片免费视频hd| 赤兔流量卡办理| 午夜影院日韩av| 欧美在线一区亚洲| 国产 一区 欧美 日韩| 我的老师免费观看完整版| 国产一区二区激情短视频| 在线看三级毛片| 内射极品少妇av片p| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 午夜久久久久精精品| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品国产高清国产av| 成人国产麻豆网| 日韩欧美精品免费久久| 99热精品在线国产| 色在线成人网| 在线观看午夜福利视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| av天堂在线播放| 听说在线观看完整版免费高清| 久久国内精品自在自线图片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 内射极品少妇av片p| 色哟哟哟哟哟哟| 婷婷六月久久综合丁香| 美女内射精品一级片tv| 国产精品伦人一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国内精品美女久久久久久| 深夜精品福利| 中国美女看黄片| 校园春色视频在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产黄片美女视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 51国产日韩欧美| 午夜视频国产福利| 看十八女毛片水多多多| 免费观看在线日韩| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产老妇女一区| 日韩人妻高清精品专区| 国产男人的电影天堂91| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久久久久久成人| 久久国产乱子免费精品| 高清毛片免费观看视频网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产成人精品久久久久久| 亚洲av.av天堂| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 一级毛片我不卡| 国产伦精品一区二区三区四那| h日本视频在线播放| 日本五十路高清| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品久久久久久久久av| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品456在线播放app| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜福利成人在线免费观看| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久久久久久久免| 国产中年淑女户外野战色| 久久久国产成人精品二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 一级av片app| 又爽又黄无遮挡网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 精品福利观看| 国产av在哪里看| 一进一出好大好爽视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 露出奶头的视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 免费搜索国产男女视频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲av熟女| 69av精品久久久久久| 好男人在线观看高清免费视频| 99热6这里只有精品| 99久久精品一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| 中出人妻视频一区二区| 在线天堂最新版资源| 五月玫瑰六月丁香| 成人亚洲精品av一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 少妇丰满av| 日本欧美国产在线视频| 内地一区二区视频在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲经典国产精华液单| 我的老师免费观看完整版| 一区二区三区高清视频在线| av中文乱码字幕在线| 搡老岳熟女国产| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 少妇熟女欧美另类| 久久久久久久亚洲中文字幕| 在线观看av片永久免费下载| 18禁在线播放成人免费| 国产精品久久电影中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国语自产精品视频在线第100页| 亚州av有码| 热99re8久久精品国产| 在线国产一区二区在线| 亚洲自偷自拍三级| 久久人人爽人人片av| 色综合色国产| 国产亚洲91精品色在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产成人精品久久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 干丝袜人妻中文字幕| 级片在线观看| 我的老师免费观看完整版| 我要搜黄色片| 亚洲人成网站高清观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 麻豆国产av国片精品| 搞女人的毛片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品国产av成人精品 | 69av精品久久久久久| 成人av在线播放网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 十八禁网站免费在线| 麻豆乱淫一区二区| av福利片在线观看| 亚洲内射少妇av| a级毛色黄片| 12—13女人毛片做爰片一| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲人成网站在线播| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日韩强制内射视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品久久久久久久末码| 波多野结衣巨乳人妻| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产精品成人久久小说 | av天堂在线播放| 午夜福利在线观看吧| 国产在线男女| 香蕉av资源在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品久久久久久久电影| 免费观看人在逋| 亚洲天堂国产精品一区在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩三级伦理在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 69av精品久久久久久| 性欧美人与动物交配| 亚洲性久久影院| 久久久成人免费电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 在线免费观看不下载黄p国产| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品精品国产色婷婷| 国产麻豆成人av免费视频| 99久久精品一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日本欧美国产在线视频| 国产午夜精品论理片| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品成人久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲无线在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩三级伦理在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日本色播在线视频| 乱人视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 97超视频在线观看视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美成人a在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产精品99久久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 国产一区二区在线av高清观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 麻豆国产av国片精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 一个人看的www免费观看视频| 综合色av麻豆| 成年av动漫网址| 久久精品国产自在天天线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 男女那种视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 最近中文字幕高清免费大全6| 免费人成在线观看视频色| 丰满的人妻完整版| 天堂影院成人在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 韩国av在线不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 高清毛片免费观看视频网站| 看免费成人av毛片| av在线天堂中文字幕| 啦啦啦韩国在线观看视频| 九色成人免费人妻av| 中文在线观看免费www的网站| www日本黄色视频网| 精品人妻熟女av久视频| 在线观看av片永久免费下载| 99久国产av精品国产电影| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产黄a三级三级三级人| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 毛片女人毛片| 大香蕉久久网| 一级毛片久久久久久久久女| 在线播放无遮挡| 深夜精品福利| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 香蕉av资源在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一进一出好大好爽视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 精华霜和精华液先用哪个| 日本黄色片子视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 日韩三级伦理在线观看| 国产精品永久免费网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人aa在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| .国产精品久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人一区二区视频在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 免费看av在线观看网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲经典国产精华液单| 欧美成人a在线观看| 亚洲性久久影院| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美一区二区亚洲| 麻豆一二三区av精品| 国产成人91sexporn| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美bdsm另类| 91精品国产九色| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品久久电影中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲国产欧美人成| 最新在线观看一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲欧美日韩高清专用| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久鲁丝午夜福利片| 草草在线视频免费看| 一区二区三区四区激情视频 | 成人永久免费在线观看视频| 97在线视频观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产清高在天天线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 五月伊人婷婷丁香| 夜夜夜夜夜久久久久| 又粗又爽又猛毛片免费看| 在线看三级毛片| 国产av在哪里看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 22中文网久久字幕| 国产视频内射| 午夜影院日韩av| 简卡轻食公司| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品一区www在线观看| 久久精品91蜜桃| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 大香蕉久久网| 国产成人a∨麻豆精品| 久久鲁丝午夜福利片| or卡值多少钱| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 色综合站精品国产| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美一区二区亚洲| 久久久久免费精品人妻一区二区| 97超视频在线观看视频| 一级黄片播放器| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品成人久久久久久| a级毛片免费高清观看在线播放| 内地一区二区视频在线| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美在线一区亚洲| av在线老鸭窝| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美激情在线99| 亚洲人成网站高清观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 老女人水多毛片| 嫩草影视91久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 真实男女啪啪啪动态图| 国产高清不卡午夜福利| 日韩制服骚丝袜av| 51国产日韩欧美| 网址你懂的国产日韩在线| 美女黄网站色视频| 亚洲av熟女| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本精品一区二区三区蜜桃| 色视频www国产| 小说图片视频综合网站| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品永久免费网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲无线在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| av在线蜜桃| av视频在线观看入口| 欧美潮喷喷水| 久久精品国产自在天天线| 亚洲最大成人手机在线| 18+在线观看网站| 欧美bdsm另类| 美女 人体艺术 gogo| 伦理电影大哥的女人| 麻豆国产97在线/欧美| 日本三级黄在线观看| 此物有八面人人有两片| 男女视频在线观看网站免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 久99久视频精品免费| 国产成人freesex在线 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久99热这里只有精品18| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 久久午夜福利片| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久久国产a免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近手机中文字幕大全| 在线观看免费视频日本深夜| 日本a在线网址| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品国产成人久久av| 99热这里只有是精品50| 午夜a级毛片| 高清毛片免费看| 国产 一区精品| 欧美丝袜亚洲另类| 国产乱人视频| 好男人在线观看高清免费视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 中国美女看黄片| 国内精品一区二区在线观看| 日本免费a在线| 91在线观看av| 免费人成视频x8x8入口观看| 国语自产精品视频在线第100页| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 在线免费十八禁| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本a在线网址| 两个人的视频大全免费| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产男人的电影天堂91| 伊人久久精品亚洲午夜| 麻豆国产av国片精品| 一a级毛片在线观看| a级一级毛片免费在线观看| av卡一久久| 男人舔奶头视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄片wwwwww| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 九九爱精品视频在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 如何舔出高潮| 在线观看av片永久免费下载| 久久久久久久久久黄片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产老妇女一区| 亚洲无线在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| av视频在线观看入口| 精品久久久噜噜| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久国内视频| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 中国国产av一级| 成人美女网站在线观看视频| 最好的美女福利视频网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久色成人| h日本视频在线播放| 午夜精品在线福利| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 天天躁日日操中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一本一本综合久久| 亚洲电影在线观看av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成人永久免费在线观看视频| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜影院日韩av| 校园春色视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 最近在线观看免费完整版| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 在线观看美女被高潮喷水网站| 小说图片视频综合网站| 99在线视频只有这里精品首页| 99久久精品热视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 最后的刺客免费高清国语| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜福利在线观看免费完整高清在 |