多菌種混合發(fā)酵棉籽餅粕制備益生菌生物活性飼料

王小磊 高 冰 楊歡歡 陳 璐

目前，我國蛋白質(zhì)飼料資源嚴重匱乏，自給率不足50%，并且由于動物性蛋白供應日趨緊張，使得植物性蛋白飼料在飼料中的應用逐漸增加。用量最大、也是最為重要的一類植物性蛋白質(zhì)飼料是餅粕類。其中棉籽餅粕富含蛋白質(zhì)，是很好的動物飼料蛋白資源。

我國是產(chǎn)棉大國，年產(chǎn)棉l 000萬以上。棉籽經(jīng)榨油后得到的餅粕中含蛋白質(zhì)30%～40%，且其蛋白質(zhì)的氨基酸成分比較完全，另外棉籽餅粕還含有糖、脂肪、磷脂、維生素、纖維素等，可作為優(yōu)質(zhì)的飼料資源。但是，因其含有對動物有毒的游離棉酚，其利用價值和使用量受到極大限制，故我國棉籽餅粕飼料的利用率不足30%，從而也制約著我國畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。

近年來，隨著對棉籽餅粕生物脫毒法的不斷研究與改進，脫毒工藝已經(jīng)由單菌種發(fā)酵脫毒發(fā)展到多菌種混合發(fā)酵脫毒。吳偉偉應用酵母菌等菌種，熊巍等應用地衣芽孢桿菌等多菌種混合發(fā)酵棉籽餅粕后，脫毒率均達90%以上。因此，采用微生物發(fā)酵法，不僅能安全脫毒，還能提高棉籽餅粕營養(yǎng)價值，使其更好地應用于畜牧業(yè)。發(fā)酵過程中適當應用益生菌，已受到越來越多的關注。

益生菌不僅能促進飼料中營養(yǎng)素降解，使動物對飼料的吸收利用更充分，還具有獨特的生物奪氧作用機制，能抑制致病菌的生長繁殖，促進動物生長，調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，從而改善胃腸道功能，提高食物消化率和生物效價，降低血清膽固醇，控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機體免疫力。

本研究擬采用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、釀酒酵母等菌種對棉籽餅粕進行發(fā)酵，以去除棉籽餅粕中的游離棉酚及降解棉籽餅粕中大分子蛋白和降低抗營養(yǎng)因子的含量，并且生產(chǎn)的飼料中含有大量益生菌、蛋白酶、短肽和乳酸等生物活性物質(zhì)，最終得到一種有利于動物消化吸收和生長發(fā)育等功效的生物活性飼料。由于本研究組對于多菌種混合發(fā)酵棉籽餅粕脫除游離棉酚的研究已經(jīng)較成熟，因此，本研究重點介紹在脫毒基礎上的益生菌生物活性飼料的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株及原料

霉菌XH001、霉菌XH002、地衣芽孢桿菌E01、枯草芽孢桿菌E02、乳酸菌SR01均為武漢工業(yè)學院生工院409實驗室保藏菌種；釀酒酵母和飼料酵母購自湖北安琪酵母股份有限公司；棉籽餅粕、麩皮、蘋果渣均由湖北鳳池實業(yè)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1000 ml，pH值自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g、蛋白胨1 g、氯化鈉 0.5 g、瓊脂 2 g、蒸餾水 100 ml，pH 值 7.0～7.2。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 801.0 ml、磷酸氫二鉀 2.0 g、乙酸鈉 5.0 g、檸檬酸三銨 2.0 g、硫酸鎂 0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂粉 15.0 g，蒸餾水 1000 ml，pH 值 6.2。

1.3 檢測指標

1.3.1 有效活菌數(shù)的檢測

霉菌、芽孢桿菌、乳酸菌計數(shù)采用平板稀釋涂布法，分別用PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，涂布平板培養(yǎng)，數(shù)菌數(shù)。酵母菌數(shù)的測定按GB／T4789.15—2003 執(zhí)行。

1.3.2 粗蛋白和氨基酸態(tài)氮的檢測

氨基酸態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法，粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法。

1.4 原料配比

原料由60%餅粕、20%蘋果渣、20%麩皮組成。各原料粗蛋白含量見表1?；旌虾笤洗值鞍缀繛?7.58%。

表1 原料的粗蛋白含量

1.5 工藝流程

工藝流程說明：混合均勻后的原料按1：1加水后進行蒸煮，蒸煮后原料含水量為50%左右，接種發(fā)酵，霉菌與酵母菌發(fā)酵一段時間后接入芽孢桿菌(E01：E02=1：1)，繼續(xù)發(fā)酵12h后接入乳酸菌種子液，繼續(xù)發(fā)酵24 h，然后在45℃下低溫干燥至飼料含水量小于15%。

1.6 發(fā)酵條件研究

1.6.1 霉菌與酵母菌接種比例的研究

兩種霉菌接種量相同，兩組酵母菌接種量相同。霉菌與酵母菌接種比例分別為1：0.8、1：1和1：1.2，在霉菌與酵母菌發(fā)酵12 h后接入芽孢桿菌 (E01：E02=1：1)，然后按上述工藝流程進行。每個處理取100 g固體發(fā)酵料接種，裝入塑料筐中，覆蓋紗布后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后檢測各菌種菌數(shù)、粗蛋白及氨基酸態(tài)氮含量。

1.6.2 芽孢桿菌接入時間的研究

分別于霉菌、酵母菌混合發(fā)酵8、12、16 h后接入芽孢桿菌 (E01：E02=1：1)繼續(xù)發(fā)酵12 h后接入乳酸菌種子液，按上述工藝流程進行。每個處理取100 g固體發(fā)酵料接種，裝入塑料筐中，覆蓋紗布后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵完成后檢測各菌種菌數(shù)、粗蛋白及氨基酸態(tài)氮含量。

1.6.3 乳酸菌接種量的研究

霉菌與酵母菌接種比例為1：1，發(fā)酵12 h后接入芽孢桿菌(E01：E02=1：1)，繼續(xù)發(fā)酵24 h后乳酸菌種子液接種量分別為5%、10%、15%，然后按上述工藝流程進行。每個處理取100 g固體發(fā)酵料接種，裝入塑料筐中，覆蓋紗布后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵完成后檢測各菌種菌數(shù)、粗蛋白及氨基酸態(tài)氮含量。

1.6.4 綜合條件的研究

對于發(fā)酵條件研究，采用5因素、4水平正交試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌與酵母菌接種比例對發(fā)酵結(jié)果的影響(見表2)

表2 霉菌與酵母菌不同接種比例后發(fā)酵效果

由表2可以看出，不同接種比例接種發(fā)酵后，飼料粗蛋白含量無顯著變化(P>0.05)，氨基酸態(tài)氮及活菌數(shù)亦無顯著變化 (P>0.05)。但是接種比例為1：1時，發(fā)酵結(jié)果較好。

2.2 芽孢桿菌接入時間對發(fā)酵結(jié)果的影響(見表3)

表3 不同芽孢桿菌接入時間對發(fā)酵結(jié)果的影響

由表3可以看出，芽孢桿菌(E01：E02=1：1)的接入時間對發(fā)酵后粗蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量及有效活菌數(shù)的影響顯著(P＜0.05)。同時可以看出，在霉菌和酵母菌發(fā)酵12 h后接入芽孢桿菌，發(fā)酵效果更好，且發(fā)酵后飼料粗蛋白含量顯著增加。

2.3 乳酸菌接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響(見表4)

表4 不同乳酸菌接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

由表4可以看出，乳酸菌接種量的不同對發(fā)酵后粗蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量及有效活菌數(shù)的影響顯著(P＜0.05)。當乳酸菌接種量為10%時，發(fā)酵效果最佳。

2.4 工藝條件的確定

根據(jù)單因素試驗，設計5因素（溫度、原料含水量、芽孢桿菌接入時間、乳酸菌接種量和發(fā)酵時間）4水平L16(45)的正交試驗進行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。由于在早期發(fā)酵試驗中發(fā)現(xiàn)霉菌與酵母菌接種比例對于后期多菌種混合發(fā)酵影響不大，故正交試驗中忽略此因素的影響，而是增加了發(fā)酵的幾個基礎因素如溫度、原料含水量和總發(fā)酵時間。正交試驗因素水平設計如表5所示，正交試驗結(jié)果分析見表6。

表5 發(fā)酵工藝條件

由表5可知，影響粗蛋白含量的最佳發(fā)酵條件為A3B3C3D2E2，即發(fā)酵溫度為32℃，原料含水量為50%，芽孢桿菌接入時間為發(fā)酵后12 h，乳酸菌接種量為10%，發(fā)酵時間為48 h，與單因素試驗結(jié)果相同。同時，對發(fā)酵結(jié)果的影響因素為A＞B＞C＞E＞D，即發(fā)酵溫度＞原料含水量＞芽孢桿菌接入時間＞發(fā)酵時間＞乳酸菌接種量。

驗證試驗后，發(fā)酵飼料粗蛋白含量達到37.92%，氨基酸態(tài)氮含量為1.88%，乳酸菌活菌數(shù)達2.3億cfu/g（干基），芽孢桿菌達18.4億cfu/g（干基）。

3 結(jié)論與展望

本試驗以棉籽餅粕與蘋果渣、麩皮混合為原料，加水后對原料進行蒸煮，待冷卻后接入菌種進行混合菌種發(fā)酵，最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度為32℃，原料含水量為50%，芽孢桿菌(E01：E02=1：1)接入時間為發(fā)酵后12 h，乳酸菌接種量為10%，發(fā)酵時間為48 h。發(fā)酵后飼料粗蛋白含量由原來的27.58%提高到37.92%，氨基酸態(tài)氮含量為1.88%，乳酸菌活菌數(shù)達2.3億cfu/g（干基），芽孢桿菌達18.4億cfu/g（干基）。

益生菌生物活性飼料的感官及適口性有很大改善，以后將對此進行更深一步的研究。本研究的應用及推廣，將極大提高棉籽餅粕的利用率，促進對益生菌飼料的研究，改善我國蛋白飼料資源匱乏的局面，更好地促進我國畜牧業(yè)的發(fā)展。

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