飼用酶與芽孢桿菌協(xié)同作用發(fā)酵豆粕的相關(guān)研究

常 磊 劉永萍 徐聰聰 陳潔梅

豆粕是大豆經(jīng)提油后得到的副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成平衡，是動(dòng)物飼養(yǎng)中常用的一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白原料，具有很大的利用價(jià)值 (趙韋璇，2006；Adetayo，2005)。但動(dòng)物對(duì)大分子豆粕蛋白的吸收明顯沒有對(duì)小分子多肽和氨基酸的吸收好 (陳培賽，2008)，同時(shí)豆粕中存在有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子（ANFs），如脲酶、胰蛋白酶抑制劑、植酸、凝集素、脂肪氧化酶和大豆抗原蛋白等，也影響了營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收和代謝，對(duì)動(dòng)物體的健康和生產(chǎn)性能產(chǎn)生不良影響，從而制約了豆粕在畜禽飼養(yǎng)中更有效的應(yīng)用 (張明峰等，1999；何玉華等，2009)。

一般認(rèn)為，豆粕發(fā)酵主要是利用微生物的作用降解豆粕中的大分子蛋白質(zhì)以及抗?fàn)I養(yǎng)因子等，或者是直接利用外源蛋白酶的作用將豆粕進(jìn)行酶解，從而達(dá)到發(fā)酵的目的。近年也有少量關(guān)于利用微生物和酶的協(xié)同作用混合處理豆粕的相關(guān)報(bào)道(方樂等，2011)。

本研究主要通過比較利用飼用復(fù)合酶酶解豆粕、芽孢桿菌發(fā)酵豆粕和復(fù)合酶加芽孢桿菌協(xié)同作用發(fā)酵豆粕的結(jié)果，得到最佳的發(fā)酵工藝條件，以提高豆粕的利用率與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本，為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豆粕：經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，由肇慶市益信農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

飼用復(fù)合酶（發(fā)酵豆粕用）：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其中蛋白酶活力為100000 U/g。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/l、蛋白胨10 g/l、瓊脂粉 20 g/l、NaCl 5 g/l，pH 值(7.4±0.2)；

液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/l、NaCl 5 g/l、蛋白胨10 g/l，pH 值(7.3±0.2)；

發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵基質(zhì)為豆粕，加適量水混勻后裝于500 ml錐形瓶中，加水量根據(jù)具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)而定。

菌種：1號(hào)菌（SN-2-1-D）和 3號(hào)菌(ND-1-2-D)，均為芽孢桿菌，暨南大學(xué)生物工程學(xué)系微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.2 方法

1.2.1 液體種子的制備

從活化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面刮取2環(huán)菌苔到液體種子培養(yǎng)基，于180 r/min、35℃搖床培養(yǎng)24 h備用。1.2.2 酶解發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 料水比對(duì)酶解豆粕酸溶性蛋白含量的影響

在500 ml錐形瓶中裝入100 g豆粕，加入不同量的自來水混勻，使料水比分別為1：0.3、1： 0.4、1：0.5、1： 0.6、1： 0.7、1： 0.8，121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌 20 min。加酶量為豆粕量的0.10%，37℃恒溫培養(yǎng)箱保溫酶解24 h，取樣后于60℃烘箱內(nèi)烘干并粉碎，測(cè)定酸溶性蛋白含量。

1.2.2.2 加酶量對(duì)酶解豆粕酸溶性蛋白含量的影響

在500 ml錐形瓶中裝入100 g豆粕，加水混勻使料水比為1： 0.6，121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后加入飼用復(fù)合酶混勻，加酶量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%，37℃恒溫培養(yǎng)箱保溫酶解24 h，取樣后于60℃烘箱內(nèi)烘干并粉碎，測(cè)定酸溶性蛋白含量。

1.2.2.3 初始酶解溫度對(duì)酶解豆粕酸溶性蛋白含量的影響

在500 ml錐形瓶中裝入100 g豆粕，加水混勻使料水比為1： 0.6，121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min，加酶量為 0.10%，分別在 20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中保溫酶解24 h，取樣后于60℃烘箱內(nèi)烘干并粉碎，測(cè)定酸溶性蛋白含量。

1.2.3 酶解發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素（料水比、加酶量、作用溫度）、3水平L9（33）的正交試驗(yàn)進(jìn)行酶解條件優(yōu)化。

1.2.4 酶解時(shí)間對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量的影響

為了更好地研究酶解過程中豆粕酸溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化情況，同時(shí)也為了減少試驗(yàn)次數(shù)，保證試驗(yàn)精確度，因此，本研究將時(shí)間因素進(jìn)行了單獨(dú)分析，即在正交試驗(yàn)確立的酶解方案基礎(chǔ)上進(jìn)行獨(dú)立的酶解時(shí)間分析，并分別于 4、8、12、20、24、36、48、60 h 時(shí)取樣，于60℃烘箱內(nèi)烘干并粉碎，測(cè)定酸溶性蛋白含量。

1.2.5 芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量的影響

基于工廠化大池發(fā)酵試驗(yàn)方面的研究，以及實(shí)際生產(chǎn)過程中的成本問題，本研究在參考課題組之前已確立菌種發(fā)酵條件(陳潔梅，2011)的基礎(chǔ)上做了如下試驗(yàn)設(shè)計(jì)：料水比1：0.7，接種量1%（0.5%1號(hào)菌+0.5%3號(hào)菌），初始發(fā)酵溫度35℃，并以此進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)研究?？紤]到菌種要有一段時(shí)間先大量繁殖，故分別于 20、24、36、48、60 h取樣，取樣后于 60 ℃烘箱內(nèi)烘干并粉碎，測(cè)定酸溶性蛋白含量。

1.2.6 飼用復(fù)合酶和芽孢桿菌混合發(fā)酵試驗(yàn)

根據(jù)前面所確立的最佳發(fā)酵條件，進(jìn)行復(fù)合酶加芽孢桿菌的混合發(fā)酵試驗(yàn)，即：料水比為1：0.7，培養(yǎng)基在121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。加酶量為0.05%，接種量為1%，初始發(fā)酵溫度為35℃，分別于12、20、24、36、48、60 h 取樣，取樣后于 60 ℃烘箱內(nèi)烘干并粉碎，測(cè)定酸溶性蛋白含量。

1.2.7 酸溶性蛋白含量的測(cè)定

根據(jù)NY/T1205—2006中的方法提取豆粕水溶性蛋白。取10 ml水溶性蛋白提取液加入10 ml 15%的三氯乙酸（TCA）溶液，振蕩片刻后靜置10 min，4000 r/min離心5 min，上清液即為酸溶性蛋白提取液。酸溶性蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，參照GB/T5009.5—2003。

1.2.8 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

稱取1.2.4中收集的樣品各1.00 g，加入0.03 mol/l Tris-HCl（pH值=8.8）緩沖液20 ml，150 r/min搖床浸提0.5 h，調(diào)節(jié)pH值8.2以上，繼續(xù)于搖床上浸提1 h，后用4000 r/min離心機(jī)離心5 min，電泳時(shí)取適量上清液與等體積的樣品緩沖液混合，并煮沸10 min使蛋白質(zhì)變性，配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，按條件進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(歐陽亮等，2008；嚴(yán)鶴松，2009)。

同時(shí)從實(shí)際生產(chǎn)條件出發(fā)，為了能夠更加明確直觀地反映豆粕在未滅菌條件下的發(fā)酵情況，本研究將豆粕在未滅菌條件下分別進(jìn)行加酶、接菌以及酶加菌處理，并取48 h后的樣品做SDS-PAGE電泳分析，與未發(fā)酵豆粕比較，分析大分子蛋白質(zhì)的降解情況。

1.2.9 樣品中總酸含量的測(cè)定

測(cè)定參照陳潔梅等(2011)的方法，總酸含量以乳酸含量表示。

1.2.10 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測(cè)定

脲酶活性的測(cè)定：參照GB/T8622—2006。

凝集素效價(jià)的測(cè)定：參照戴大章(2005)以及孫冊(cè)等(1986)的方法測(cè)定。

植酸含量的測(cè)定：參照傅啟高等(1997)的方法測(cè)定。

脂肪氧化酶含量的測(cè)定：參照張小俠等(1997)的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 料水比對(duì)酶解豆粕酸溶性蛋白含量的影響(見圖1)

圖1 不同料水比對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量的影響

圖1結(jié)果表明，隨著料水比的增加，樣品中酸溶性蛋白含量呈逐漸增大的趨勢(shì)，并在料水比達(dá)到1：0.7后開始變緩。根據(jù)需要，本研究選擇料水比1：0.5、1：0.6和1：0.7作為多因素正交試驗(yàn)料水比因素的3個(gè)水平。

2.1.2 加酶量對(duì)酶解豆粕酸溶性蛋白含量的影響(見圖2)

圖2 不同加酶量對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量的影響

圖2結(jié)果表明，當(dāng)酶添加量＜0.10%時(shí)，加酶量對(duì)酸溶性蛋白含量的升高影響較大；當(dāng)酶添加量＞0.10%時(shí)，增加酶的添加量對(duì)酸溶性蛋白含量的升高影響不大，這說明酶的添加量有一個(gè)逐漸飽和的趨勢(shì)。同時(shí)也根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的需要，盡可能降低酶的用量，降低生產(chǎn)成本，所以，選擇加酶量0.05%、0.10%和0.15%作為多因素正交試驗(yàn)加酶量因素的3個(gè)水平。

2.1.3 初始酶解溫度對(duì)酶解豆粕酸溶性蛋白含量的影響(見圖3)

圖3 不同初始酶解溫度對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量的影響

圖3結(jié)果表明，隨著初始酶解溫度的升高，樣品中酸溶性蛋白含量呈逐漸增大的趨勢(shì)，至30℃后基本維持不變，所以，本研究選擇初始酶解溫度30、35和40℃作為多因素正交試驗(yàn)初始酶解溫度因素的3個(gè)水平。

2.2 酶解發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)直觀結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素（料水比、加酶量、作用溫度）3水平L9（33）的正交試驗(yàn)進(jìn)行酶解條件優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平表如表1所示，實(shí)施方案和結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

從表2可以直觀地看出，料水比和初始酶解溫度的極差最大，料水比和初始酶解溫度對(duì)發(fā)酵樣品中酸溶性蛋白含量影響最大。理論最佳酶解發(fā)酵方案為A3B2C3，即料水比為1：0.7、加酶量為0.10%、初始酶解溫度為40℃。

2.2.2 正交試驗(yàn)方差分析

正交試驗(yàn)方差分析的結(jié)果見表3。從表3可以看出，上述3個(gè)因素中，料水比和初始酶解溫度對(duì)酶解豆粕中酸溶性蛋白含量的影響極顯著，加酶量影響不顯著。

表2 正交試驗(yàn)實(shí)施方案和結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.2.3 酶解條件的確定

根據(jù)正交試驗(yàn)所確立的理論最佳酶解方案為A3B2C3，即料水比為 1：0.7、加酶量為0.10%、初始酶解溫度為40℃?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中要最大限度的降低生產(chǎn)成本，同時(shí)結(jié)合表3所示的結(jié)果，加酶量對(duì)酶解豆粕中酸溶性蛋白含量的影響并不顯著，所以，綜合考慮，本研究選擇最少加酶量作為最終的酶解方案，即料水比為1：0.7、加酶量為0.05%、初始酶解溫度為40℃。

2.3 加酶、加菌、酶菌協(xié)同作用處理豆粕后樣品中酸溶性蛋白含量的比較

在只加復(fù)合酶作用的情況下，酶解時(shí)間對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量影響的結(jié)果如圖4中曲線①所示。結(jié)果表明，從8～24 h樣品中的酸溶性蛋白含量急劇增加，這是由于酶的作用快速高效，能夠很快地利用底物進(jìn)行酶解，而隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，其酸溶性蛋白含量呈現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢(shì)，但增速明顯降低。

芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量影響的結(jié)果如圖4中曲線②所示。結(jié)果表明，36 h后菌種代謝活動(dòng)旺盛，開始大量利用底物，樣品中酸溶性蛋白含量開始快速增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)酸溶性蛋白含量持續(xù)增加。

復(fù)合酶加芽孢桿菌混合發(fā)酵對(duì)豆粕酸溶性蛋白含量影響的結(jié)果如圖4中曲線③所示。結(jié)果表明，12～36 h之間，樣品中酸溶性蛋白含量急劇增加，之后增速變緩，48 h時(shí)達(dá)到最大值。

圖4的結(jié)果表明，利用酶加菌的協(xié)同作用處理豆粕，效果優(yōu)于單獨(dú)加酶和單獨(dú)加菌的情況，在發(fā)酵48 h時(shí)酸溶性蛋白含量達(dá)到最高，為24.55%，這在實(shí)際生產(chǎn)過程中具有較好的指導(dǎo)意義。

圖4 不同處理豆粕酸溶性蛋白含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

2.4 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS－PAGE）

酶解樣品大分子蛋白降解后的分子量變化情況如圖5 SDS－PAGE電泳圖譜所示。從圖5可以看出，樣品經(jīng)滅菌處理后酶解4～12 h，40 kD以上的蛋白質(zhì)基本上被降解。隨著酶解時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，大分子蛋白質(zhì)進(jìn)一步被降解，36 h后基本上都被降解成分子量為20 kD或以下的小分子。

圖5 不同酶解時(shí)間豆粕中大分子蛋白質(zhì)的降解情況

圖6 未滅菌條件下豆粕中大分子蛋白質(zhì)降解情況

圖6為基質(zhì)在未滅菌條件下，加酶、加菌、酶加菌處理48 h后樣品中蛋白質(zhì)分子量的變化情況。結(jié)果表明，3種處理均能夠較好降解豆粕中的大分子蛋白質(zhì)，基本達(dá)到滅菌條件下(圖5)蛋白質(zhì)降解的水平，特別是酶加菌處理（圖6中的3）與滅菌酶解處理相同時(shí)間（圖5中的7）的電泳條帶相似，蛋白質(zhì)降解后分子量基本在20 kD或以下，說明復(fù)合酶和芽孢桿菌協(xié)同作用處理豆粕有利于抵抗基質(zhì)未滅菌狀態(tài)下雜菌的影響，提高了發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。

2.5 發(fā)酵豆粕中總酸含量的比較

不同處理的發(fā)酵豆粕的總酸含量（以乳酸含量計(jì)）見表4。結(jié)果表明：基質(zhì)在滅菌和未滅菌狀態(tài)，3種不同處理均能夠提高其總酸含量，其中基質(zhì)在未滅菌狀態(tài)下酶加菌以及加菌處理后所測(cè)得的總酸含量比在滅菌狀態(tài)下高，推測(cè)是雜菌的作用使生成了更多的有機(jī)酸。其中酶加菌協(xié)同處理（未滅菌狀態(tài)）乳酸含量由1.26%提高到4.70%，提高了2.7倍。

表4 不同處理的發(fā)酵豆粕中乳酸含量

豆粕經(jīng)過復(fù)合酶和芽孢桿菌的發(fā)酵處理以后，可以產(chǎn)生大量的有機(jī)酸和芽孢桿菌活菌體，能很好地改善動(dòng)物消化道的微生態(tài)環(huán)境，從而提高動(dòng)物的免疫力，減少腸道病害的發(fā)生，在乳豬飼料中使用時(shí)，可以大大降低仔豬消化道疾病的發(fā)病率，起到預(yù)防仔豬下痢的效果(俞曉輝，2008)。

2.6 發(fā)酵樣品中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測(cè)定

處理前后豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化如表5所示。結(jié)果表明，在滅菌和未滅菌狀態(tài)下，經(jīng)過3種不同的處理方式，豆粕中的各種抗?fàn)I養(yǎng)因子均能夠被降解，其中在未滅菌狀態(tài)下利用酶加菌處理豆粕，各抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解水平均能達(dá)到較好效果，符合實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的需要。

由于豆粕中的胰蛋白酶抑制因子含量與其中的脲酶含量呈正相關(guān)關(guān)系，通過測(cè)定脲酶活性就可間接地知道該豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量的高低，所以本研究將豆粕中的脲酶活性作為檢測(cè)胰蛋白酶抑制因子的間接衡量指標(biāo)。

3 討論

酸溶性蛋白指能溶于15%三氯乙酸的分子量較小的多肽或小肽，也包括了游離的氨基酸，易于被動(dòng)物腸道吸收和消化利用，所以通過檢測(cè)處理后樣品中的酸溶性蛋白含量，可以反映出豆粕蛋白質(zhì)被降解的情況，它是豆粕發(fā)酵過程中的一個(gè)重要參數(shù)。

表5 處理前后豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化

本研究利用芽孢桿菌和復(fù)合酶混合發(fā)酵豆粕，既能縮短發(fā)酵周期，又能利用芽孢桿菌抵抗其他雜菌的影響，提高效率，降低生產(chǎn)成本，還能通過產(chǎn)品中含有的大量的芽孢桿菌活菌體改變動(dòng)物腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)飼養(yǎng)動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗能力，減少抗生素的使用。

4 結(jié)論

以豆粕為原料進(jìn)行加酶、加菌、酶加菌協(xié)同處理試驗(yàn)，通過發(fā)酵條件的優(yōu)化及對(duì)比，在菌液接種量1%（0.5%1號(hào)菌+0.5%3號(hào)菌）、加酶量0.05%（蛋白酶活性50 U/g），料水比1：0.7，初始發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間48 h的條件下，酸溶性蛋白含量從2.74%提高到24.55%，豆粕中大分子蛋白質(zhì)基本降解為分子量20 kD或以下的小分子物質(zhì)，總酸含量（以乳酸計(jì)）從1.26%提高到4.70%，主要抗?fàn)I養(yǎng)因子大部分被降解，其各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到了發(fā)酵豆粕行業(yè)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(葛向陽，2010)，這對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。

15篇，刊略，需者可函索）