幾種養(yǎng)殖魚類血清轉(zhuǎn)氨酶活性參考值的探討

王麗宏 葉元土 張寶彤 蕭培珍 唐精 張波

我國(guó)水域遼闊，氣候多樣，漁業(yè)和生物資源豐富，是世界上水產(chǎn)業(yè)相對(duì)較發(fā)達(dá)的國(guó)家之一，這些豐富多樣的水生種質(zhì)資源為我國(guó)水產(chǎn)業(yè)及國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。但隨著水產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，產(chǎn)生了一系列影響其健康發(fā)展的不利因素，如環(huán)境影響（病毒、細(xì)菌、代謝毒素等）、飼料保管不善（脂肪氧化、蛋白質(zhì)變性）、原料組分等，導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物各種疾病的頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。到目前為止，我們對(duì)魚病的判斷還主要停留于定性描述，很難從實(shí)質(zhì)上作出定量分析。近年來，關(guān)于動(dòng)物健康參數(shù)的調(diào)查在人和鼠上的研究相對(duì)較多，但在魚類方面尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此，建立一套系統(tǒng)的適合養(yǎng)殖魚類的健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，已成為當(dāng)前水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)先導(dǎo)。

血清中各種生化指標(biāo)比機(jī)體的理化組成能更快地反映組織的健康狀況和機(jī)體的代謝機(jī)能。本文主要側(cè)重研究了不同魚類間血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性。AST和ALT是反映肝臟健康狀態(tài)最敏感的酶學(xué)指標(biāo)，對(duì)肝病的診斷治療具有重要價(jià)值。通過本研究，以期為其標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一個(gè)前期的鋪墊，為我國(guó)漁業(yè)的健康、生態(tài)養(yǎng)殖，為養(yǎng)殖環(huán)境的改善等提供重要的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用鳊魚 (Parabramis pekinensis)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、鯽魚(Carassius auratus)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、鯉魚(Cyprinus carpio)、鏡鯉(mirror carp)、羅非魚(Tilapia)均為各地區(qū)主要養(yǎng)殖品種，其規(guī)格見表1。

1.2 采樣

試驗(yàn)魚全部稱重，測(cè)量體長(zhǎng)，隨即進(jìn)行尾靜脈采血，離心（3500 r/min、10 min），分離血清，置液氮中低溫保存，用于血清ALT、AST活性的測(cè)定。同時(shí)，解剖、分離肝（胰）臟，迅速取其適量樣品放入波恩氏液（Bouin's）中固定，用于肝臟冰凍切片的制作，其余樣品放置低溫保存用于測(cè)定肝臟脂肪含量。

表1 不同地區(qū)幾種魚類間的生長(zhǎng)情況

1.3 測(cè)定指標(biāo)及分析方法

1.3.1 轉(zhuǎn)氨酶活性及肝（胰）臟脂肪含量

血清中天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)兩項(xiàng)生化指標(biāo)均采用島津全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行分析測(cè)定。

肝胰臟樣品解凍后迅速采用恒溫105℃烘干失水法進(jìn)行干燥，然后采用索氏脂肪提取法進(jìn)行粗脂肪含量的測(cè)定。

1.3.2 肝（胰）臟冰凍切片

取適量固定（Bouin's）后的肝胰臟組織，修成規(guī)整的組織塊，包埋、修塊、切片，切片厚度為 2～3 μm、干片、染色（蘇木精、伊紅）、干燥、中性樹膠封片、干燥后進(jìn)行觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差及參考范圍，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)各種魚類肝臟脂肪含量(見表2)

表2 幾種魚類間的肝（胰）臟脂肪含量

2.2 不同地區(qū)各種魚類血清轉(zhuǎn)氨酶情況

試驗(yàn)測(cè)定了幾種魚類間的血清ALT、AST的指標(biāo)，ALT、AST活性及ALT/AST區(qū)間范圍見表3、表4。

表3 幾種魚類間的血清轉(zhuǎn)氨酶活性范圍

表4 幾種魚類間的血清轉(zhuǎn)氨酶活性(U/l，X±S)

2.3 冰凍切片

解剖、分離肝臟，立即取部分肝臟組織，放入波恩氏液（Bouin's）中固定待用。取適當(dāng)大小的組織塊進(jìn)行修整、清洗、切片（3 μm）、干片、染色、中性樹膠封片、干燥、觀察拍照。部分魚的肝組織冰凍切片（A-D和A1-D1為互相對(duì)應(yīng)不同倍數(shù)下的同一尾魚,依次為鯉魚、草魚、鳊魚、黃顙魚、鯽魚，其中 A-D×100，A1-D1×400，黃顙魚的冰凍切片為表3數(shù)據(jù)中沒有包括在內(nèi)的病魚）見圖1。

由圖1可見，CC-1、DD-1肝臟存在明顯的脂肪化，特別是圖D、D-1更為嚴(yán)重，細(xì)胞邊界不清晰，肝臟細(xì)胞中充滿了脂肪滴，細(xì)胞質(zhì)嚴(yán)重破碎，細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞核偏移甚至導(dǎo)致溶解消失，此外，還可見一些肝臟組織存在輕度的纖維化。

3 討論

血清AST和ALT是肝病診斷的重要指標(biāo)，正常時(shí)血清中AST和ALT含量較低，因此，其活性變化對(duì)了解肝病狀況具有重要的意義。ALT絕大部分位于細(xì)胞漿，AST主要位于線粒體，肝損傷較輕時(shí)，僅限細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞漿內(nèi)的ALT釋放入血；在肝細(xì)胞受損嚴(yán)重時(shí)，線粒體里的AST釋放入血。因此，通過對(duì)兩種轉(zhuǎn)氨酶正常參考值的建立，以便更快速地對(duì)魚類肝病進(jìn)行診斷，具有十分重要的意義。

圖1 部分魚的肝組織冰凍切片

由于我國(guó)各地自然環(huán)境的不同，各地魚類區(qū)系組成存在一定的差異。因此，試驗(yàn)范圍涉及較廣，主要包括江蘇、河北、廣東、湖北等相關(guān)地區(qū)的主要品種，如草魚、鳊魚、鯉魚、鯽魚、黃顙魚、羅非魚等養(yǎng)殖魚類。由試驗(yàn)結(jié)果可見，不同魚類間轉(zhuǎn)氨酶值存在一定差異，其中羅非魚的ALT、AST活性相對(duì)較大，而且不同地區(qū)的同一種魚類轉(zhuǎn)氨酶活性也存在差別，這可能與魚的品種、食性等具有一定的關(guān)聯(lián)，此外，不同地區(qū)的養(yǎng)殖模式也存在差異，不易達(dá)到條件的完全統(tǒng)一，且以上這些條件均會(huì)對(duì)動(dòng)物的生理狀況產(chǎn)生影響。因此，為了更有效地分析評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)在對(duì)其血清生化指標(biāo)檢測(cè)的同時(shí)，結(jié)合其肝臟組織學(xué)觀察。通過冰凍切片觀察可見，某些個(gè)體肝臟存在嚴(yán)重的脂肪化，如圖E/E1為黃顙魚，脂肪化較嚴(yán)重，且該個(gè)體對(duì)應(yīng)的脂肪含量為54.48%，AST和ALT活性分別為423 U/l、277 U/l，均明顯高于其均值 22.94±11.58%、(217.72±61.50)U/l、(18±5.94)U/l，具有一定的相關(guān)性。通過本試驗(yàn)的初步調(diào)查，將為該標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步建立和完善奠定一定的基礎(chǔ)。同時(shí)，結(jié)合各地區(qū)的養(yǎng)殖品種、管理狀況、飼養(yǎng)環(huán)境及養(yǎng)殖模式等，建立適合于該地區(qū)的生化指標(biāo)參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖和調(diào)控，將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。但由于影響動(dòng)物血清生化指標(biāo)的因素較多，當(dāng)前的試驗(yàn)研究正著手從細(xì)胞分子水平方面進(jìn)行更深入的探討。

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