新疆棉花秸稈中乳酸菌的分離與鑒定

張永輝 嚴(yán) 萍 阿布都克尤木·麥麥提 麥熱姆妮薩·艾麥爾 樊 振 烏斯?jié)M·依米提

新疆是中國產(chǎn)棉大區(qū)，多年來棉花種植面積占到全國的1/3，種植面積達(dá)2000多萬畝，棉花總產(chǎn)量200多萬噸。棉稈年均產(chǎn)量為540萬噸。棉稈除一部分用于還田外，大多數(shù)被用作柴禾。開發(fā)利用棉稈資源,是提高棉田經(jīng)濟效益的有效途徑之一。

許國英等(1998)[1]對棉花秸稈營養(yǎng)成分進(jìn)行了測得,棉稈中的粗蛋白含量為9.96%，優(yōu)于稻草、麥秸；粗纖維含量為32.15%；木質(zhì)素含量為36.2%，比其它主要農(nóng)作物含量高2.5～3倍。但由于在自然狀態(tài)下的棉稈粗蛋白含量低而粗纖維含量高，因此消化率低、適口性差，農(nóng)戶普遍很少喂養(yǎng)家畜。只有通過青貯、氨化等方法處理，才能解決這一問題[2]。而添加乳酸菌青貯是目前研究的熱點，牧草上天然附著的乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中起著非常重要的作用。本研究以新疆吐魯番地區(qū)棉花秸稈為實驗對象，采用傳統(tǒng)生理生化和16S rRNA相結(jié)合的方法，分離出4珠乳酸菌，并從中篩選出優(yōu)良乳酸菌，為進(jìn)一步以棉花秸稈為原料制作青貯飼料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

2009年10月采集新疆吐魯番地區(qū)棉花秸稈樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS+CaCO3瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、糖類發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基等，參照楊潔彬(1991)、凌代文(1999)、東秀珠(2001)的方法配制。

1.1.3 設(shè)備

GMSX-280型手提式壓力蒸氣消毒器：北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；ISO900型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司生產(chǎn)；超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；GXZ型智能光照培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠制造；PHS-501精密酸度計：上海鵬順科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；Perkin Elmer CeneAmp 9600 PCR儀：北京北加美因生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；DYCP-31C型瓊脂糖電泳儀：北京市六一儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取棉花秸稈30 g，裝入盛有220 ml 0.9%滅菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，充分?jǐn)嚢?，將此溶液稀釋?0-2～10-7倍，取 10-4、10-5、10-6和 10-74 個稀釋度，將稀釋后的懸液涂布在MRS+CaCO3平板上，培養(yǎng)條件為30℃，72 h。根據(jù)菌落的顏色、大小、光澤、是否有透明圈，挑取單菌落，多次劃線分離純化后，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察菌體大小、形狀及排列方式。將純菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后（懸液：30%液體石蠟=1：1）4℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌屬種的鑒定

凡是革蘭氏染色陽性、過氧化酶陰性的菌株初步定為乳酸菌[5]，乳酸菌的生理生化試驗參照相關(guān)楊潔彬(1991)、凌代文(1999)、東秀珠(2001)方法，確定屬。

1.2.3 16S rRNA基因序列同源性分析

將分離的乳酸菌菌株，采用CTAB法提取基因組DNA[6-7]，采用正向引物27f:5-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3，反向引物1492R:5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，進(jìn)行PCR擴增[8]，擴增條件：PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度正確的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果通過http://www.ncbi.nih.nlm.gov網(wǎng)站用BLAST進(jìn)行序列同源性比對，然后在GenBank注冊序列號。用MEGA4.0的Neighbor-Joining[9]法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗。

1.2.4 乳酸菌產(chǎn)酸試驗

將分離并鑒定的4株乳酸菌分別按5%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h測定不同菌株發(fā)酵液pH值并繪制產(chǎn)酸速率曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征及個體形狀

初步分離出菌株13株。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶反應(yīng)得到革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性符合乳酸菌特征的菌株 4 株, 編號為 Z1、Z2、Z4、Z5，進(jìn)一步在MRS平板上觀察菌落形態(tài)，結(jié)果見表1。

表1 乳酸菌的形態(tài)特征

經(jīng)過菌體菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、過氧化氫酶等試驗，表明有4株菌為乳酸菌，其中菌株Z1、Z2革蘭氏陽性，圓球形，對生，菌落為乳白色，扁平，表面光滑，菌落周圍具有透明圈。Z4、Z5革蘭氏陽性，短桿狀，單個或呈鏈狀排列，菌落為乳白色，中央凸起，表面光滑，菌落周圍具有透明圈。

2.2 乳酸菌鑒定結(jié)果

對分離得到的純菌株進(jìn)行部分生理生化試驗鑒定，結(jié)果見表2。

將分離的4株乳酸菌進(jìn)行部分生理生化實驗，結(jié)果表明：均為革蘭氏染色陽性，不運動，在H2O2酶實驗、H2S實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗呈陰性。其中Z1、Z2在15℃、45℃，pH值4.5，6.5%NaCl生長良好，不發(fā)酵乳糖和蔗糖。結(jié)合形態(tài)特征，初步定為片球菌屬。Z4、Z5在15℃，pH值4.5生長，在45℃，6.5%NaCl不生長。結(jié)合形態(tài)特征，初步定為乳桿菌屬。

2.3 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

表2 乳酸菌屬的鑒定結(jié)果

16S rRNA基因序列分析顯示，菌株Z1(HQ589248)的16S rRNA基因序列長度為1407 bp核苷酸，菌株Z2(HQ589249)的16S rRNA基因序列長度為1377 bp核苷酸，菌株Z4(HQ589250)的16S rRNA基因序列長度為1372 bp核苷酸，菌株Z5(HQ589251)的16S rRNA基因序列長度為1390 bp核苷酸。與從GenBank中相關(guān)乳酸菌菌種的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較，并用MEGA4.0的Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖1。菌株Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)與 Pediococcus pentosaceus(AJ305321)的相似性為99%。菌株 Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)與 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum(ACGZ01000098)的相似性為100%。一般來講，在種分類等級上，如果2個分類單位間的16S rRNA序列同源性大于97.5%，則認(rèn)為屬于同一個種[10－11]。因此，將 Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)鑒定為戊糖片球菌，將Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)鑒定為植物乳桿菌。

圖1 分離乳酸菌菌株16S rRNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 產(chǎn)酸速率測定結(jié)果(見圖2)

圖2 37℃發(fā)酵過程中pH值的變化

由圖2可以看出，4株菌接種2～6 h內(nèi)菌株發(fā)酵液的pH值迅速下降，6～14 h pH值下降緩慢，并且都有較強的產(chǎn)酸能力，6 h后pH值都能達(dá)到4.0以下，其中戊糖片球菌中Z2的產(chǎn)酸能力較強，14 h pH值就能達(dá)到3.5；植物乳桿菌中Z5的產(chǎn)酸能力較強，14 h pH值就能達(dá)到3.48。在青貯飼料的制備過程中pH值的快速降低能夠顯著抑制青貯原料中的有害微生物，如酵母、霉菌等，從而提高青貯飼料的品質(zhì)。因此菌株Z2和Z5可被用作以棉花秸稈為原料的青貯飼料添加劑。

3 結(jié)論

3.1 從新疆吐魯番地區(qū)棉花秸稈中分離得到Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)、Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)4株菌，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，參閱《伯杰士細(xì)菌學(xué)手冊》(第九版)及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》鑒定為Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)為戊糖片球菌，Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)為植物乳桿菌。

3.2 對已鑒定的乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸速率試驗，4株菌都有較強的產(chǎn)酸能力，戊糖片球菌中Z2菌株的產(chǎn)酸能力較強，14 h pH值就能達(dá)到3.5。植物乳桿菌中Z5菌株的產(chǎn)酸能力較強，14 h pH值就能達(dá)到3.48?？捎米饕悦藁ń斩挒樵系那噘A飼料添加劑。

3.3 青貯是在厭氧條件下，通過附生于植物體的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，厭氧發(fā)酵產(chǎn)生有機酸(主要是乳酸)，導(dǎo)致pH值降低，從而殺滅各種微生物或抑制其繁衍，達(dá)到保存青綠飼料的目的(Mc－Donald等，1991)。然而由于自然界牧草上存在的乳酸菌含量少，僅占細(xì)菌總數(shù)的0.01%～1%,所以在發(fā)酵過程中乳酸菌很難迅速的形成優(yōu)勢菌群，不能在短時間內(nèi)降低pH值，青貯的效果得不到明顯的改善。因此，正確選擇青貯添加劑在很大程度上對畜牧業(yè)的發(fā)展起到促進(jìn)作用。接種劑中的乳酸菌通常是從作物或青貯料中篩選出來的，之所以被選擇是因為其繁殖迅速，并且是同型發(fā)酵。由于它們是自然界中的同型發(fā)酵菌，一般認(rèn)為它們將對青貯質(zhì)量產(chǎn)生積極的影響。實驗從新疆吐魯番地區(qū)棉花秸稈中分離的4株乳酸菌，來源于棉花秸稈，更容易適應(yīng)青貯發(fā)酵環(huán)境。本實驗室將進(jìn)一步以這兩株菌作為添加劑來制備以棉花秸稈為原料的青貯飼料，研究這兩株菌對棉花秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，為充分利用新疆棉花秸稈、發(fā)展畜牧業(yè)提供理論依據(jù)。

[1]許國英,熱合木都拉,馬英杰.棉花秸稈的飼用價值研究[J].新疆畜牧業(yè),1998(3):10-11.

[2]吳杰.新疆棉花秸稈利用現(xiàn)狀分析和探討[J].中國棉花,2006,33(2):9-11.

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