黃芪多糖的萃取提純及組分鑒定

宋建華，劉玉玲

黃芪為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)分布地域廣，具有補(bǔ)氣、升陽(yáng)、益衛(wèi)、固表、利水等作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，黃芪含有多種有效成分，如皂甙類(lèi)、多糖類(lèi)等，其中多糖類(lèi)組分是發(fā)揮補(bǔ)中益氣作用的主要成分，具有抗腫瘤活性[1]。中藥多糖組分的提取方法較多，但提取物多含較多蛋白、纖維等雜質(zhì)，影響其使用效果。本文建立了高純度黃芪多糖的提取、純化方法，并對(duì)黃芪多糖主要組分進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 黃芪（產(chǎn)地山西沁源縣，3年生，經(jīng)中醫(yī)專(zhuān)家鑒定為綿黃芪），95%乙醇 （阿拉丁試劑上海有限公司），鹽酸（阿拉丁試劑上海有限公司），乙醚、苯酚（北京化工廠），蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室制備）。

1.2 儀器 高效液相儀（淮安瑞美克儀器有限公司），紫外光譜儀（美國(guó)McPherson公司），F(xiàn)A135S型電子天平（上海豪昇科學(xué)儀器有限公司），氫氧化鈉 （碧云天生物試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的提取 黃芪烘干恒重后粉碎，2號(hào)篩篩選粉末，稱(chēng)取 100 g，置提取器中，加蒸餾水浸泡 12 h（W∶W=1∶5），11 000 g×min高速離心離心10 min，保留上清。沉淀再加蒸餾水浸泡 12h（W∶W=1∶5），11000g×min 高速離心離心 10min，保留上清，棄去沉淀。合并上清液，加入4倍體積的95%乙醇，靜置 1 h，2 500 g×min 5 ℃低溫離心 20 min，收集沉淀，冷凍干燥后得淡黃色粗多糖。

1.3.2 粗多糖的純化 粗多糖溶入適量蒸餾水中，采用Sevag法除去蛋白，置DEAE-52離子交換柱（2.5 cm×32 cm）洗脫（洗脫液：pH 8.0，0.45%NaCl，流速：50 ml/h）。洗脫液采用Sephadex G-200凝膠柱層析。各組分經(jīng)透析、濃縮、醇沉、洗滌、真空冷凍干燥，得純化黃芪多糖。

1.3.3 純化多糖純度檢測(cè)

1.3.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱(chēng)取恒重?zé)o水葡萄糖15 mg，用蒸餾水定容至100 ml，吸取定容后葡萄糖溶液依次梯度稀釋為15.0～105.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)液，于各管中分別加入60 g/L的苯酚溶液0.6 ml，濃硫酸3 ml，漩渦振蕩后靜置15 min，采用紫外光譜儀與490 nm處掃描，測(cè)定吸光度，空白校正采用蒸餾水，以吸光度（Y）對(duì)相應(yīng)濃度（X，mol/L）進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱(chēng)取牛血清白蛋白4 mg，生理鹽水定容為100 ml，吸取定容后牛血清白蛋白溶液依次梯度稀釋為5.0～30.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)液，于各管中依次加入Serva blue-G工作液1 ml，渦旋振蕩后靜置10 min，采用紫外光譜儀與595 nm處掃描，測(cè)定吸光度，空白校正采用生理鹽水，以吸光度（Y）對(duì)相應(yīng)濃度（X,mol/L）進(jìn)行線性回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 多糖含量及純度測(cè)定 分別取純化黃芪多糖及粗多糖1 g，加蒸餾水1 000 ml，配制成1 mg/ml多糖溶液，分別在波長(zhǎng)490及595 nm處掃描，測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算化多糖及和蛋白雜質(zhì)含量。

1.3.4 多糖組分分析

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、木二糖、燕麥-葡聚糖各0.25 g，分別用超純水定容至25 ml。用超純水稀釋至20 g/L，用 0.22 μm水性濾膜過(guò)濾，柱溫30℃，洗脫液16 mmol/L、NaOH溶液，進(jìn)樣量200 μl，流速1 ml/min色譜條件下將各質(zhì)量濃度的樣品進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，以單糖標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)濃度（X,mol/L）進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 純化黃芪多糖組分鑒定 純化黃芪多糖5 mg，加入1.5 ml 5 mol/L三氟乙酸溶液，封管，水解。0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，取 0.1 ml過(guò)濾液，10 ml定容。采用高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè),檢測(cè)條件，離子柱 CarbopaeTMPAI，柱溫 30℃，洗脫液 16 mmol/L、NaOH 溶液，進(jìn)樣量 200 μl，流速 1 ml/min，測(cè)定其各峰面積，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)組分含量。

2 結(jié) 果

紫外光譜掃描后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水體醇沉法提取黃芪多糖純度為32%，進(jìn)行層析提純后黃芪多糖純度為89%，純化后黃芪多糖蛋白雜質(zhì)含量約為1.5%。高效液相色譜分析結(jié)果顯示，黃芪多糖的組成成分包括葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖等，其中葡萄糖及木糖是主要組成成分，濃度分別為2.84%及1.67%，黃芪多糖的組分按濃度計(jì)，分別為葡萄糖2.84%，木糖1.67%，果糖0.5%，蔗糖0.4%，麥芽糖和乳糖<0.4%。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪多糖高效液相色譜圖

3 討 論

多糖是黃芪的有效成分之一，多糖成分萃取是其中藥制劑工藝之一，水提醇沉法是多糖提取的經(jīng)典工藝，能夠去除不溶性雜質(zhì)[2]，但既往的研究發(fā)現(xiàn)，水提醇沉法提取的中藥多糖成分的純度較低，蛋白雜質(zhì)含量較高，蛋白雜質(zhì)容易引起過(guò)敏反應(yīng)等不良反應(yīng)，對(duì)于針劑等純度要求較高的劑型不能滿足需要。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，采用水提醇沉提取的黃芪多糖其純度為32%，含有較多的雜質(zhì)。凝膠柱層析是藥物組分提純的常用方法，該方法性能穩(wěn)定，利用層析液的電荷吸引，對(duì)于多糖類(lèi)物質(zhì)的分離純化具有較好的效果[3]，有研究對(duì)香菇多糖提取，其純度接近80%[4]。在研究中對(duì)黃芪多糖采用水提醇沉法初步粗提，獲粗制的黃芪多糖，然后采取纖維素凝膠柱層析，提取的多糖純度達(dá)到89%，其中蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量不足2%，進(jìn)一步對(duì)其組分進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，其主要成分為葡萄糖及木糖，尚有少量的蔗糖、果糖等成分。本文結(jié)果說(shuō)明采用水提醇沉結(jié)合纖維素凝膠柱層析能夠提取高純度的黃芪多糖。

[1]鄭 舉，劉紅云.HPLC-ELSD測(cè)定黃芪多糖注射液中黃芪甲苷的含量[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44(7)：16-18.

[2]劉曄瑋，宋 海，馬振遠(yuǎn)，等.甘草多糖提取工藝的研究[J].中成藥，2006，28（6）：729-731.

[3]朱德艷.幾種香菇多糖純化方法的比較[J].農(nóng)產(chǎn)品加工.創(chuàng)新版，2009，4（4）：14-15.

[4]屈永年，曾凡龍，高海濤，等.香菇多糖的提取和純化的研究[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2003，16（6）：537-538.