印度洋深海沉積物中酵母菌IR08的分離與鑒定

趙昌會(huì) ，孫 佳 ，黃翔玲

（1.湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425100；2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門(mén) 361005；3.國(guó)家海洋局海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005）

海洋中酵母菌的含量比較低，一般情況下，遠(yuǎn)海的水體中酵母菌的濃度低于10 cells/dm3，而污染的沉積物中為100 cells/g以上，底質(zhì)中酵母菌的含量受沉積物類型的影響比較大[1]。可通過(guò)濃縮水樣或加富培養(yǎng)來(lái)分離酵母菌，但對(duì)于含量較少、生長(zhǎng)較慢的酵母菌株，則需要運(yùn)用特殊的富集法分離[2]。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與自然環(huán)境的差異，加上采樣的困難，限制了人們對(duì)深海酵母菌的研究。Nagahama等[3－6]從1 000～11 000 m的深海樣品中分離到多種酵母菌，其中一些菌株與已知菌株同源性差異較大，具有研發(fā)的新潛力。本文對(duì)分離自印度洋中脊底質(zhì)的深海酵母IR08進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株IR08由黃翔玲同志采用PDA培養(yǎng)基從印度洋 IR-T3C1站（31.0877°S、59.1124°E）水深4 051 m 的洋底0～3 cm層底質(zhì)樣品中分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%、pH 7.0（深海海水配制）；同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.05%、酵母膏 0.02%、（NH4）2SO40.5%、KH2PO40.1%（3.4%（W/V）NaCl溶液配制）。

1.2 方法

1.2.1 深海酵母的顯微鏡觀察 挑取少量的新鮮酵母菌混勻于載玻片的無(wú)菌水中，蓋上蓋玻片，油鏡下觀察。

1.2.2 深海酵母菌的溫度和鹽度試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取少量的酵母接于鹽度分別為0、24、34、100的液體培養(yǎng)基中，分別在 4、10、25、35℃下培養(yǎng)（以不加菌液為對(duì)照），每隔24 h觀察培養(yǎng)液混濁度的變化。

1.2.3 深海酵母菌的碳代謝試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取少量酵母菌稀釋于碳源利用鑒定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，取0.4 cm3加到TH04酵母樣真菌鑒定板上（杭州微生物試劑有限公司），35℃搖床培養(yǎng)5 d（100 r/min）。

1.2.4 深海酵母菌DNA的提取與擴(kuò)增 以酵母染色體DNA的提取為參考[7]。

1.2.5 深海酵母菌IR8的鑒定 菌株的染色體DNA 采用特異引物[8]ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′和 LR6：5′-CGCCAGTTCTGCTTA-3′，擴(kuò)增26S rDNA的D1/D2區(qū)及ITS區(qū)在內(nèi)的一段核糖體DNA。其PCR擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)中包括：DNA模板 50 ng、正向及反向引物（各 10-5mol）、Taq DNA聚合酶（4 U）、2.5 mmol/μdm3的 dNTP 5 μL、5 μL 的10×PCR 緩沖液、DDW 補(bǔ)至 50 μL，26S rRNA 基因擴(kuò)增程序：95℃預(yù)熱 4 min，94℃變性 1 min、52℃退火1 min、72℃延伸2 min，36個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 10 min。對(duì)擴(kuò)增的26S rDNA片段直接測(cè)序，測(cè)序引物選用F63、LR3；返回結(jié)果通過(guò)DNAMAN軟件處理，以此為對(duì)比目標(biāo)，通過(guò)FASTA網(wǎng)上分析搜索EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找同源性最高菌株，采用鄰接法[7]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IR08的菌落和菌體形態(tài)

IR08菌落淡紅色，圓形突起，較濕潤(rùn)，直徑1～2 mm，易挑取。細(xì)胞卵圓形，單端芽殖（如圖1）。

圖1 IR08的細(xì)胞形態(tài)（100×）

2.2 不同溫度和鹽度對(duì)IR08生長(zhǎng)的影響

IR08菌株受鹽度的影響較小，在25～35℃生長(zhǎng)良好，10℃以下生長(zhǎng)緩慢（如表1）。

表1 酵母IR08在不同時(shí)間、鹽度和溫度下的生長(zhǎng)狀況

2.3 IR08的碳源利用特征

IR08除了能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及半乳糖外，還能利用尿素、纖維二糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇和、松二糖、山梨醇等，但不能利用木醇、海藻糖、肌醇、木糖。

2.4 IR08菌株的鑒定

將26S rDNA的D1/D2區(qū)的序列測(cè)序，輸入到EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，得到rDNA分子同源性相似度最高為 Pichia guilliermondii-AY188372（98.8%），構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2。

圖2 IR08的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

酵母的鑒定主要借助于生理學(xué)特征，但其碳和氮的同化實(shí)驗(yàn)常表現(xiàn)易變或區(qū)別不明顯，如紅酵母屬、擲孢酵母屬、木森頓酵母屬、鎖擲孢酵母屬等，需用ITS和5.8S DNA基因序列測(cè)定、18S rDNA及26S rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的基因序列[1]，這為發(fā)現(xiàn)新種提供了良好的途徑。如Nagahama在深海底質(zhì)中發(fā)現(xiàn)新種[6]。

季也蒙畢赤酵母能在含鉻量較高的條件下生長(zhǎng)，并將其吸收[9]、也可富集重金屬銅[10]及防治果實(shí)產(chǎn)后的腐爛[11]；分離自海洋的季也蒙畢赤酵母具有高產(chǎn)菊粉酶[12]等活性，深海分離的酵母菌IR08在環(huán)境修復(fù)及果實(shí)防腐等方面的價(jià)值有待于研究開(kāi)發(fā)。致謝：

本研究在國(guó)家海洋局第三海洋研究所葉德贊研究員的實(shí)驗(yàn)室完成，對(duì)他在本研究中的指導(dǎo)和支持，謹(jǐn)致謝忱！

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