注射用頭孢拉宗鈉的體內(nèi)外抗菌活性研究

白小剛，胡辛欣，李聰然，楊信怡，張偉新，婁人慧，游雪甫

頭孢拉宗（cefbuperazone）是由日本富山化學(xué)工業(yè)制藥株式會(huì)社于 20世紀(jì) 70年代開(kāi)發(fā)，并于1985年上市的第三代頭孢類廣譜抗生素，其作用機(jī)制與其他頭孢菌素類抗生素相似，主要通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成從而發(fā)揮殺菌作用[1-2]。頭孢拉宗在國(guó)外已有多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，其安全性和有效性已得到充分的驗(yàn)證，具有穿透力強(qiáng)、體內(nèi)分布廣的優(yōu)點(diǎn)，在諸多部位均可達(dá)到有效治療濃度[1-2]。目前我國(guó)也已有廠家對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行研發(fā)和生產(chǎn)[3]。因此，為評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)頭孢拉宗的抗菌活性，本實(shí)驗(yàn)以頭孢美唑、頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢米諾、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢吡肟為對(duì)照，對(duì)國(guó)產(chǎn)頭孢拉宗的體內(nèi)外抗菌活性進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 注射用頭孢拉宗鈉購(gòu)自桂林南藥股份有限公司；注射用頭孢美唑鈉購(gòu)自日本第一三共普樂(lè)發(fā)株式會(huì)社（Daiichi Sankyo Propharma Co., Ltd.）；注射用頭孢西丁鈉購(gòu)自海口市制藥廠有限公司；注射用頭孢替坦二鈉購(gòu)自重慶市慶余堂制藥有限公司；注射用頭孢米諾鈉購(gòu)自江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司；注射用頭孢唑啉鈉購(gòu)自華北制藥股份有限公司；頭孢呋辛購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；注射用頭孢哌酮鈉購(gòu)自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠；注射用鹽酸頭孢吡肟購(gòu)自悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 MH 瓊脂培養(yǎng)基、中國(guó)藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；MH 肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Difco 公司；Nitrocephin 紙片購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；高活性干酵母購(gòu)自廣州丹寶利有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株 受試菌株為2008 – 2009年間自北京地區(qū)醫(yī)院收集的 20 種共 663株臨床分離致病菌（其中革蘭陽(yáng)性菌 146株，革蘭陰性菌517株，產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株共 535株），包括金黃色葡萄球菌 37株[產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株 34株，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）16株]、表皮葡萄球菌 35株[產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株 8株，耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）17株]、化膿鏈球菌18株、肺炎鏈球菌 19株、糞腸球菌 18株（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株 1株）、屎腸球菌 19株、大腸埃希菌 55株[均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株，其中產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株 26株]、肺炎克雷伯桿菌 56株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株，其中產(chǎn)ESBLs 菌株 26株）、銅綠假單胞菌 37株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株）、鮑曼不動(dòng)桿菌 37株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株）、奇異變形桿菌 37株（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株 22株）、普通變形桿菌 37株（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株 36株）、陰溝腸桿菌 37株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株）、產(chǎn)氣腸桿菌 37株（均為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株）、聚團(tuán)腸桿菌 17株（產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株 16株）、弗勞地枸櫞酸桿菌 37株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株）、異型枸櫞酸桿菌 37株（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株 36株）、雷極普魯菲登桿菌 19株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株）、摩根摩根菌 37株（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株 33株）和黏質(zhì)沙雷菌 37株（均為產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株）。質(zhì)控菌株選用金黃色葡萄球菌 ATCC29213、肺炎鏈球菌 ATCC49619、糞腸球菌 ATCC29212、大腸埃希菌 ATCC25922、ATCC35218 和肺炎克雷伯桿菌 ATCC700603、銅綠假單胞菌 ATCC27853，所有質(zhì)控菌株均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），且最低抑菌濃度（MIC）均在美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）規(guī)定范圍內(nèi)。細(xì)菌 β-內(nèi)酰胺酶鑒定采用Nitrocephin 紙片法，并按照 CLSI[4]規(guī)定方法鑒定細(xì)菌 ESBLs。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 外觀健康 ICR 小鼠 720 只，雌雄各半，4～5 周齡，體重 18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。實(shí)驗(yàn)前 1 天預(yù)養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 MIC 測(cè)定 參照 CLSI[5]標(biāo)準(zhǔn)方法，采用平皿二倍稀釋法和 Denley 多點(diǎn)接種器進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。藥物用 MH 肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行二倍稀釋，使其終濃度依次為0.03～128 μg/ml，將適量各梯度濃度藥物分別加入平皿中，與 MH 瓊脂培養(yǎng)基混勻。以多點(diǎn)接種器接種實(shí)驗(yàn)菌（接種量為1×104cfu/點(diǎn)），接種后置 35℃恒溫培養(yǎng) 18 h 觀察結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)的平皿中所含藥物的最小濃度即為MIC。

1.2.2 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 選取金黃色葡萄球菌 12株、大腸埃希菌 13株、肺炎克雷伯桿菌 12株為實(shí)驗(yàn)菌，采用試管二倍稀釋法確定各實(shí)驗(yàn)菌的 MIC（接種量為5×105cfu/ml）后，依次吸取未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)各管的培養(yǎng)液各 0.1 ml，轉(zhuǎn)移到不含抗生素的瓊脂平皿中，置 35℃恒溫培養(yǎng)18 h 觀察結(jié)果，菌落數(shù)小于 50 個(gè)（至少 99.9%接種菌被殺死）的平皿中所含最低藥物濃度即為MBC。

1.2.3 殺菌曲線（KCs）測(cè)定 以金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌 ATCC25922 為實(shí)驗(yàn)菌，過(guò)夜培養(yǎng)后分別接種于 MH 瓊脂培養(yǎng)基中（接種量為1×105cfu/ml），35℃培養(yǎng) 30min 后加入頭孢拉宗鈉注射液，調(diào)整藥物的終濃度分別為8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、0.5 MIC、0（空白對(duì)照組），置 35℃繼續(xù)培養(yǎng)，并分別在培養(yǎng) 2、4、6、8、12、24 h 時(shí)取樣，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上計(jì)活菌落數(shù)，繪制時(shí)間-菌落數(shù)對(duì)數(shù)曲線即 KCs。

1.2.4 誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn) 以金黃色葡萄球菌ATCC29213、金黃色葡萄球菌 15、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌ATCC700603、肺炎克雷伯桿菌 7 為實(shí)驗(yàn)菌，選取頭孢美唑、頭孢西丁、頭孢替坦和頭孢米諾作為對(duì)照藥物。以各抗生素對(duì)受試菌株的 1/4 MIC 每天轉(zhuǎn)種，誘導(dǎo) 20 d，并于誘導(dǎo)第4、8、12、16、20 天時(shí)，采用金黃色葡萄球菌 MH 肉湯微稀釋法測(cè)定抗生素對(duì)各菌株的 MIC，觀察藥物對(duì)受試菌的誘導(dǎo)耐藥情況。

1.2.5 體內(nèi)抗菌活性測(cè)定 將 720 只 ICR 小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組 10 只。以大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌9613、肺炎克雷伯桿菌 7、金黃色葡萄球菌 15 為感染菌，選取頭孢美唑、頭孢唑啉作為對(duì)照藥物。用 5%高活性干酵母稀釋受試菌株，于小鼠腹腔注入 100%最小致死量（MLD）的菌液 0.5 ml，實(shí)驗(yàn)組小鼠感染后 15min 和 6 h 分別皮下給藥2 次，空白對(duì)照組小鼠感染后不給藥，觀察 7 d 內(nèi)小鼠的生存數(shù)量，并利用 Bliss 法[6]計(jì)算半數(shù)有效劑量（ED50）及其 95%可信區(qū)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

給藥方案：①大腸埃希菌 ATCC25922 感染量為1.3×106cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗1.5、2、3、4.2、6 mg/kg，頭孢美唑 25、35、50、70、100 mg/kg，頭孢唑啉 3.5、5、7、10、14 mg/kg；②大腸埃希菌 1515 感染量為3.6×106cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗 0.06、0.09、0.13、0.18、0.25 mg/kg，頭孢美唑 2.5、3.5、5、7、10 mg/kg，頭孢唑啉 2.5、3.5、5、7、10 mg/kg；③肺炎克雷伯桿菌 9613 感染量為7×106cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗 0.18、0.25、0.35、0.5、0.7 mg/kg，頭孢美唑 5、7、10、14、20 mg/kg，頭孢唑啉 5、7、10、14、20 mg/kg；④肺炎克雷伯桿菌 7 感染量為7×105cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗50、70、100、140、200 mg/kg，頭孢美唑 1000 mg/kg，頭孢唑啉 1000 mg/kg；⑤金黃色葡萄球菌 15 感染量為2.6×105cfu/鼠，藥物劑量分別為：頭孢拉宗50、70、100、140、200 mg/kg，頭孢美唑 25、35、50、70、100 mg/kg，頭孢唑啉 3.5、5、7、10、14 mg/kg。所有藥物配制時(shí)均按實(shí)際活性藥物計(jì)算濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間檢測(cè)結(jié)果的比較采用 LSD 法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離菌的 MIC 分布

體外 MIC 測(cè)定結(jié)果表明，注射用頭孢拉宗鈉具有廣譜抗菌活性，對(duì) 663株臨床分離菌均有不同程度的抗菌作用，其中對(duì) 146株革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性較弱，對(duì) 517株革蘭陰性菌普遍具有較強(qiáng)的抗菌作用（表1）。

表1 頭孢拉宗對(duì) 663株臨床分離菌的體外抗菌活性（MIC，μg/ml）Table 1 The antibacterial activity of cefbuperazone against 663 clinical isolated bacteria in vitro (MIC, μg/ml)

頭孢拉宗對(duì)革蘭陽(yáng)性菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）的抗菌活性較弱，MIC50值在 16 μg/ml以上，抗菌活性與頭孢米諾、頭孢替坦相近。對(duì)糞腸球菌和屎腸球菌的抗菌活性弱，MIC50值均大于128 μg/ml，抗菌活性與其他同類受試藥物相近。

頭孢拉宗對(duì)多種革蘭陰性菌均具有較高的抗菌活性。其中對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌及其產(chǎn) ESBLs 菌株的抗菌活性較強(qiáng)，MIC90值均為8 μg/ml，抗菌活性與頭孢替坦和頭孢米諾相近，較頭孢吡肟和頭孢西丁強(qiáng) 2～8 倍，明顯優(yōu)于頭孢呋辛、頭孢唑啉和頭孢哌酮。對(duì)腸桿菌的抗菌活性較強(qiáng)，MIC50值在 0.125～8 μg/ml 范圍內(nèi)，MIC90值在 8 μg/ml以上，抗菌活性較頭孢替坦、頭孢呋辛和頭孢哌酮強(qiáng) 2～32 倍，明顯優(yōu)于頭孢美唑、頭孢西丁、頭孢米諾和頭孢唑啉，弱于頭孢吡肟；但對(duì)雷極普魯菲登桿菌的抗菌活性較弱，MIC50、MIC90值均為64 μg/ml，抗菌活性略優(yōu)于頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢唑啉和頭孢呋辛，弱于頭孢米諾、頭孢吡肟、頭孢替坦和頭孢美唑 4～32 倍。

頭孢拉宗對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等非發(fā)酵桿菌抗菌活性較弱，MIC50、MIC90值均大于 128 μg/ml，與多數(shù)其他同類受試藥物相近，其中對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌活性弱于頭孢哌酮和頭孢吡肟，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌活性稍弱于頭孢米諾和頭孢吡肟。

2.2 最低殺菌濃度（MBC）

注射用頭孢拉宗鈉對(duì) 12株金黃色葡萄球菌的 MBC50/MIC50、MBC90/MIC90比值均為2，對(duì)13株大腸埃希菌和 12株肺炎克雷伯桿菌的MBC50/MIC50、MBC90/MIC90比值均為1（表2）。

2.3 殺菌曲線（KCs）

頭孢拉宗鈉注射液對(duì)大腸埃希菌 ATCC25922、金黃色葡萄球菌 ATCC29213 的殺菌曲線測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

表2 頭孢拉宗對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的 MBC/MIC 比較Table 2 MBC/MIC of cefbuperazone against E.coli, K.pneumoniae and S.aureus

圖1 頭孢拉宗對(duì)大腸埃希菌 ATCC25922 的殺菌活性Figure 1 The antibacterial activities of cefbuperazone against E.col ATCC25922

圖2 頭孢拉宗對(duì)金黃色葡萄球菌 ATCC29213 的殺菌活性Figure 2 The antibacterial activities of cefbuperazone against S.aureus ATCC29213

2.4 誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)

誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分別以 1/4 MIC 劑量誘導(dǎo) 20 d 后，頭孢拉宗及其對(duì)照藥對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的抗菌活性無(wú)明顯改變（表3）。

2.5 體內(nèi)抗菌活性

頭孢拉宗及其對(duì)照藥皮下給藥對(duì)感染小鼠的體內(nèi)療效結(jié)果顯示，頭孢拉宗對(duì)金黃色葡萄球菌15 感染小鼠的體內(nèi)療效與頭孢美唑相近（P＞0.05），但弱于頭孢唑啉（P＜0.01）；頭孢拉宗對(duì)大腸埃希菌 ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌 9613、肺炎克雷伯桿菌 7 感染小鼠的體內(nèi)療效明顯優(yōu)于頭孢美唑和頭孢唑啉（均P＜0.01，表4）。

3 討論

頭孢拉宗，又名頭孢拉宗鈉、頭孢布宗鈉、乙氧哌甲氧頭孢菌素鈉等，其化學(xué)名稱為(6R, 7S)-7-[(2R, 3S)-2-(4-乙基 2, 3-二氧代-1-哌嗪甲酰氨基)-3-羥基丁酰氨基]-7-甲氧基-3-{[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫]甲基}-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，屬第三代頭孢類抗生素，具有廣譜的抗菌活性，對(duì)革蘭陽(yáng)性、革蘭陰性細(xì)菌和厭氧菌均有作用，其中對(duì)厭氧菌作用優(yōu)于一般第三代頭孢菌素類抗生素。此外，7 位甲氧基的引入使得頭孢拉宗對(duì) β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性增加，且優(yōu)于多數(shù)同類品種[1-2]，而本研究結(jié)果也證實(shí)，頭孢拉宗對(duì)產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株具有較強(qiáng)的抗菌作用。

本研究表明，頭孢拉宗對(duì)革蘭陰性菌特別是大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抗菌作用較弱。除銅綠假單胞菌、雷極普魯菲登桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌外，頭孢拉宗對(duì)大腸埃希菌（包括產(chǎn) ESBLs 大腸埃希菌）、肺炎克雷伯桿菌（包括產(chǎn) ESBLs 肺炎克雷伯桿菌）、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、聚團(tuán)腸桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、異型枸櫞酸

桿菌、摩根摩根菌和黏質(zhì)沙雷菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性，其對(duì)革蘭陰性菌的體外抗菌活性大多優(yōu)于頭孢西丁、頭孢美唑、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢替坦和頭孢呋辛，但稍弱于頭孢吡肟；對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的體外抗菌活性與頭孢替坦和頭孢米諾相近。MBC和 KCs 測(cè)定結(jié)果表明，頭孢拉宗對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌均呈現(xiàn)殺菌作用，且以 1/4 MIC 劑量誘導(dǎo) 20 d 對(duì)其抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的活性無(wú)明顯影響。頭孢拉宗皮下給藥對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌腹腔感染小鼠具有較好的體內(nèi)抗菌活性，對(duì)大腸埃希菌 ATCC25922、大腸埃希菌 1515、肺炎克雷伯桿菌 7、肺炎克雷伯桿菌 9613 感染小鼠的體內(nèi)療效明顯優(yōu)于頭孢美唑和頭孢唑啉，對(duì)金黃色葡萄球菌 15 感染小鼠的體內(nèi)療效與頭孢美唑相近，弱于頭孢唑啉。

表3 頭孢拉宗及其對(duì)照藥的體外誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果（MIC，μg/ml）Table 3 In vitro induction of resistance to cefbuperazone and control drugs (MIC, μg/ml)

表4 頭孢拉宗及其對(duì)照藥皮下給藥對(duì)感染小鼠的體內(nèi)療效比較Table 4 Effects on systemically infected mice of cefbuperazone and control drugs given by subcutaneous

綜上，本研究對(duì)照多種其他同類藥物，研究證實(shí)了國(guó)產(chǎn)頭孢拉宗具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗菌活性，為該藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù)。

[1]Takano S, Takakura I, Ochiai H, et al.Studies on beta-lactam antibiotics for medicinal purpose.XIII.Synthesis and structureactivity relationships of 7 beta-[alpha-(4-alkyl-2,3-dioxo-1-piperazinecarboxamido)-alpha-substituted acetamido]-7 alphamethoxycephalosporanic acids.Yakugaku Zasshi, 1982, 102(7):629-645.

[2]Taki H, Yasuda T, Ochiai H, et al.7-alpha-methoxycephalosporins and pharmaceutical composition comprising the same: US, 4263292.1981-04-21.

[3]Ci ZM, Fucm, Cui MQ, et al.Synthesis of cefbuperazone.J Chengdu Univ (Nat Sc Ed), 2009, 28(3):199-201.(in Chinese)慈志敏, 付超美, 崔名全, 等.頭孢拉宗的合成.成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 28(3):199-201.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement.2006, 26(3):M100-S16.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically;approved standard-seventh edition.2006, 26(2):M7-A7.

[6]Zhang WG, Lin FS, Li BB.Calculations and procedures of Pharmacolog.Beijing: People’s Medical Publishing House, 1988:351.(in Chinese)張文貴, 林福生, 李北波.藥理學(xué)計(jì)算與程序.北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1988:351.