苦參堿對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜細(xì)胞因子和自由基的影響

鐘振東，熊永愛，楊玲

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種自身免疫性的直腸、結(jié)腸的慢性炎性和潰瘍性病變，屬臨床疑難病。主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液血便等癥狀[1]。目前 UC 病因與機(jī)制尚不十分明確，但已明確免疫反應(yīng)異常，細(xì)胞因子分泌失衡是其發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)[2]。IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α是公認(rèn)能介導(dǎo) UC 發(fā)病的細(xì)胞因子，UC 活動(dòng)期IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的分泌量與病變程度成正相關(guān)[3]。

自由基對(duì)結(jié)腸黏膜細(xì)胞損傷也是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的重要機(jī)制。當(dāng)機(jī)體氧自由基產(chǎn)生過多，而抗氧化物質(zhì)活性較低時(shí)，氧自由基在引起脂質(zhì)氧化的同時(shí)，增加黏膜的通透性，使吞噬細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)一步加強(qiáng)，產(chǎn)生更多的氧自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷[4]。

中藥苦參能改變 UC 患者腹痛、腹瀉等臨床癥狀，是臨床上治療 UC 常用中藥之一[5]?？鄥A是從苦參中提取的有效成分，現(xiàn)代研究證明，苦參堿能抑制炎癥介質(zhì)釋放，抗炎作用與氫化可的松相似，但沒有氫化可的松的毒副反應(yīng)?？鄥A能降低毛細(xì)血管通透性，抑制肉芽組織增生。此外，還能對(duì)抗自由基氧化對(duì)細(xì)胞導(dǎo)致的損傷，抑制纖維生成等作用[6]。但目前關(guān)于苦參堿對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子和自由基的影響尚無報(bào)道，本研究通過苦參堿對(duì) TNBS 誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎治療，探討苦參堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子和自由基的影響，進(jìn)而研究苦參堿干預(yù)UC 機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 SD 大鼠 60 只，8～12 周齡，體重 180～220 g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，合格證號(hào) scxk（川）2008-24，飼養(yǎng)于 IVC 級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2 藥品和試劑 苦參堿由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。三硝基苯磺酸（TNBS）（批號(hào):107K5008）購自美國 Sigma 公司；IL-1β（批號(hào)：E10J0402）、TNF-α（批號(hào)：E10J0403）、IL-6（批號(hào)：E10J0404）、IL-8（批號(hào)：E10J0405）試劑盒由成都杰納生物科技有限公司提供；SOD（批號(hào)：20101015）和 MDA（批號(hào)：20101112）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及 UC 模型復(fù)制 SD 大鼠適應(yīng)1 周飼養(yǎng)后，隨機(jī)分成 4 組，每組 15 只動(dòng)物。禁食 24 h 后，除正常組外，其他組按 3 ml/kg 體重腹腔注射 20%烏拉坦溶液麻醉。將一直徑約2mm，長約 12cm 的橡膠輸液管由肛門輕緩插入，深度為8cm，注入 2%TNBS 溶液 100 mg/kg 體重，讓大鼠保持平躺，自然清醒[7]。

1.2.2 給藥方案 正常組和 UC 模型組灌胃給予等劑量生理鹽水；陽性對(duì)照組，按 600 mg/kg 體重灌胃給予柳氮磺胺吡啶溶液；苦參堿組，按180 mg/kg 體重灌胃給予苦參堿溶液。

1.2.3 IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、SOD 和 MDA測定 第21 天處死大鼠，取長度約 0.4cm 的結(jié)腸勻漿，300×g離心 10min，取上清液分裝，–20℃保存，按試劑盒說明書方法檢測。

1.2.4 光鏡檢查 剪取結(jié)腸病變最明顯處 2cm放于 10%中性緩沖甲醛溶液中固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度 4～6 μm，HE 染色，置 100 倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間數(shù)據(jù)采用對(duì)照t檢驗(yàn)，以±s表示，以P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著差異，以P＜0.01 為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)結(jié)腸細(xì)胞內(nèi) IL-1β 和 TNF-α 的影響

與模型組相比，給藥組結(jié)腸組織 IL-1β 水平均極顯著降低（P＜0.01），表明柳氮磺胺吡啶和苦參堿均能下調(diào)炎性細(xì)胞分泌 IL-1β；給藥組結(jié)腸組織TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.01），表明兩組藥物能下調(diào)炎性細(xì)胞分泌 TNF-α 水平（表1）。

表1 IL-1β 和 TNF-α 水平測定結(jié)果（±s ，n = 10）Table 1 The testing results of IL-1β and TNF-α in colon tissues (±s , n = 10)

表1 IL-1β 和 TNF-α 水平測定結(jié)果（±s ，n = 10）Table 1 The testing results of IL-1β and TNF-α in colon tissues (±s , n = 10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Notes: *P＜0.05, **P＜0.01 vs model; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs SAPA.

組別 Groups IL-1β（pg/mg） TNF-α（pg/mg）正常組 Normal group 60.00±9.97**△△ 61.44±18.77**△△模型組 Model group 627.14±209.04△△ 109.33±35.49陽性組 SASP group 133.30±39.39**△ 77.56±13.05**苦參堿組 Matrine group 268.89±102.50** 84.88±12.56*

2.2 苦參堿對(duì)結(jié)腸細(xì)胞中 IL-6、IL-8 的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中 IL-6、IL-8 水平均極顯著性升高（P＜0.01），表明結(jié)腸組織局部免疫細(xì)胞分泌促炎因子十分活躍。與模型組相比，苦參堿組、柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸組織中 IL-6水平均顯著降低，苦參堿組具有極顯著性（P＜0.01），表明苦參堿和柳氮磺胺吡啶都能下調(diào)結(jié)腸組織異常升高的 IL-6 水平。與模型組相比，苦參堿組、柳氮磺胺吡啶組均能顯著降低結(jié)腸組織中 IL-8水平（P＜0.01）（表2）。

表2 結(jié)腸組織中 IL-6、IL-8 水平測定結(jié)果（±s ，n = 10）Table 2 The testing results of IL-6 and IL-8 in colon tissues (±s , n = 10)

表2 結(jié)腸組織中 IL-6、IL-8 水平測定結(jié)果（±s ，n = 10）Table 2 The testing results of IL-6 and IL-8 in colon tissues (±s , n = 10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Notes: *P＜0.05, **P＜0.01 vs Model; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs SAPA.

組別 Groups IL-6（pg/mg） IL-8（pg/mg）正常組 Normal group 8.91±2.36**△ 164.68±55.37**模型組 Model group 14.27±5.46 297.00±94.97△陽性組 SASP group 9.82±2.17* 199.25±62.69**159.86±24.55**△苦參堿組 Matrine group 8.81±1.69**△

2.3 苦參堿對(duì)結(jié)腸細(xì)胞中 SOD、MDA 的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中 SOD極顯著性降低，MDA 水平極顯著性升高（P＜0.01），表明結(jié)腸組織局部自由基系統(tǒng)處于失衡狀態(tài)。與模型組相比，苦參堿組、柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸組織中 SOD 水平極顯著性升高（P＜0.01），說明苦參堿能明顯上調(diào)結(jié)腸組織異常降低的 SOD水平。與模型組相比，苦參堿組、柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸組織中 MDA 水平均極顯著降低（P＜0.01），說明苦參堿能明顯下調(diào)結(jié)腸組織異常升高的MDA 水平（表3）。

表3 大鼠結(jié)腸組織 SOD、MDA 水平測定結(jié)果（±s ，n = 10）Table 3 The testing results of SOD and MDA in colon tissues (±s , n = 10)

表3 大鼠結(jié)腸組織 SOD、MDA 水平測定結(jié)果（±s ，n = 10）Table 3 The testing results of SOD and MDA in colon tissues (±s , n = 10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Notes: *P＜0.05, **P＜0.01 vs model; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs SAPA.

組別 GroupsSOD（U/mg） MDA（pg/mg）正常組 Normal group 38.93±9.34**△△ 0.94±0.23**模型組 Model group 17.61±4.45 2.89±1.47△△陽性組 SASP group 30.88±6.60**△△ 1.15±0.14**苦參堿組 Matrine group 28.72±7.75 **△ 1.51±0.44**

2.4 光鏡觀察

模型組鏡下可見潰瘍，病變主要在黏膜下層，組織水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴濾泡增生為主（圖1A 和 B）?？鄥A組和柳氮磺胺吡啶組潰瘍較少并可見已愈合的潰瘍組織，組織水腫和充血明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少，（圖1C 和D）。圖1E 為正常組。鏡檢評(píng)分結(jié)果見表4。

圖1 各組結(jié)腸病理切片 100×Figure 1 Pathology pictures of each group 100×

表5 結(jié)腸顯微鏡檢查評(píng)分（±s ，n = 10）Table 5 The microscopy scores of colon tissues(±s ，n = 10)

表5 結(jié)腸顯微鏡檢查評(píng)分（±s ，n = 10）Table 5 The microscopy scores of colon tissues(±s ，n = 10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note: *P＜0.05, **P＜0.01 vs model

組別 Groups 鏡檢評(píng)分 Microscopy scores正常組 Normal group 0.0000±0.0000**模型組 Model group 3.9161±1.5009陽性組 SASP group 2.1829±1.5888*苦參堿組 Matrine group 1.4822±2.4404**

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用 TNBS 誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生潰瘍性結(jié)腸炎模型，探討了苦參堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子和自由基的影響。TNBS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎呈慢性變化，病程較長，各種炎癥介質(zhì)如 PGE2、TNB2、LTC4和 IL 等發(fā)生明顯變化，MPO 含量增高，與人類潰瘍性結(jié)腸炎相似[8]。

細(xì)胞因子在 UC 發(fā)病中的作用已得到公認(rèn)，TNF-α 是目前已知的與炎癥性腸病（IBD）發(fā)病關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子。TNF-α 在 IBD 患者的血、糞便和腸組織中水平均有所增加，主要通過使中性粒細(xì)胞聚集、上調(diào)凝血酶原效應(yīng)等參與 UC 的發(fā)病[9]。UC 發(fā)病過程中促炎因子 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8 等細(xì)胞因子分泌旺盛，苦參堿可以明顯降低黏膜細(xì)胞過表達(dá)的細(xì)胞因子水平，表明苦參堿抗?jié)冃越Y(jié)腸炎與其調(diào)節(jié)細(xì)胞因子失衡有關(guān)。

氧自由基是促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，SOD 可加速清除炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的對(duì)結(jié)腸黏膜有損傷的大量超氧化物離子等自由基，增強(qiáng)組織細(xì)胞的抗氧化能力，顯著地減輕結(jié)腸黏膜炎癥，促進(jìn)潰瘍愈合[10]。UC 發(fā)生時(shí)，結(jié)腸黏膜組織中 SOD 含量明顯下降，MDA 含量明顯增高，本實(shí)驗(yàn)中苦參堿可顯著升高 SOD 含量，降低 MDA 含量，說明苦參堿通過抑制氧自由基反應(yīng)干預(yù)了 UC 發(fā)病過程，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

綜上，苦參堿能明顯抵抗?jié)冃越Y(jié)腸炎炎性反應(yīng)，對(duì)潰瘍損傷有明顯修復(fù)作用，通過調(diào)節(jié)腸黏膜細(xì)胞因子失衡和氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化功能干預(yù)了 UC 發(fā)病過程，但其具體作用靶點(diǎn)和干預(yù)機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步深入研究。

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