高效價(jià)冷凝集素對(duì)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響及消除方法探討

曾令軍 李 莉 吳 慶 黃鳳萍 孫余惠 馬筱玲

安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230001

高效價(jià)冷凝集素對(duì)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響及消除方法探討

曾令軍 李 莉 吳 慶 黃鳳萍 孫余惠 馬筱玲

安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230001

目的 探討高效價(jià)冷凝集對(duì)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響及消除方法。方法 對(duì)有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)檢標(biāo)本分別采用未處理直接檢測(cè)法、37℃水浴法、血漿置換法，利用sysmex XE-2100血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的手工顯微鏡計(jì)數(shù)項(xiàng)目WBC、RBC、PLT及血涂片分類(lèi)結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果 有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)檢標(biāo)本水浴前、后PLT、Hb、MPV和白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果與實(shí)際相符，其它多項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際不符，尤其是RBC、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)相差十分懸殊，且WBC、RBC、PLT散點(diǎn)圖和直方圖均明顯異常并有相應(yīng)報(bào)警；而置換血漿法除PLT結(jié)果偏低外其它檢測(cè)參數(shù)，均與手工顯微鏡計(jì)數(shù)項(xiàng)目相符合，散點(diǎn)圖和直方圖正常，報(bào)警消失。結(jié)論 對(duì)有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)標(biāo)本的檢測(cè)，無(wú)論是未處理直接檢測(cè)，還是經(jīng)過(guò)37℃水浴后檢測(cè)，除Hb、MPV、白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果與實(shí)際吻合外，高效價(jià)冷凝集素對(duì)多項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)有嚴(yán)重干擾；而置換血漿法可以有效排除這些干擾，因置換過(guò)程會(huì)造成PLT的丟失，故可采用手工計(jì)數(shù)或者直接上機(jī)檢測(cè)的PLT結(jié)果報(bào)告。

高效價(jià)；冷凝集素；血常規(guī)；置換血漿

近年來(lái)，隨著血液分析儀在各級(jí)醫(yī)院的普及，以其快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)得到臨床的歡迎。在實(shí)際工作中，發(fā)現(xiàn)有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)檢標(biāo)本，對(duì)血液分析儀的檢測(cè)參數(shù)、散點(diǎn)圖和直方圖有顯著干擾作用，導(dǎo)致多項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)結(jié)果與實(shí)際不符?，F(xiàn)將我們工作中遇到的2例高效價(jià)冷凝集，對(duì)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行分析，并對(duì)消除方法進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 某男，76歲。2011年4月8日因肢端青紫、伴有疼痛感就診。入院前查血常規(guī)時(shí)發(fā)現(xiàn)試管內(nèi)血液呈果凍樣凝塊(見(jiàn)圖10)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。冷凝集素效價(jià)大于1∶10000，TBi l:37μmol/L,DBi l:17μmol/L,滲透壓：328mOsmol/(kg.H2O),診斷為凝集素綜合癥（CAS），后經(jīng)治療癥狀緩解后出院。 2011年6月9日再次就診，血常規(guī)結(jié)果見(jiàn)表2；冷凝集素效價(jià)大于1∶2048。再次診斷為凝集素綜合癥入院。

1.2 儀器與試劑 日本Sysmex公司的XE-2100血細(xì)胞分析儀和配套原裝試劑、質(zhì)控物，0.9%生理鹽水，100μl德國(guó)Eppendor f移液器和吸頭，水平離心機(jī)，Olympus CX21雙目顯微鏡。儀器使用前已校準(zhǔn)，每日測(cè)定三個(gè)水平配套質(zhì)控物，結(jié)果均在靶值允許范圍內(nèi)再進(jìn)行日常標(biāo)本的檢測(cè)。

1.3 分析方法

1.3.1 血常規(guī)分析方法 分為儀器法、顯微鏡手工計(jì)數(shù)法以及血涂片的手工分類(lèi)法。早晨空腹抽取3管2ml靜脈血加入EDTA- K2抗凝管中，1管不作處理，在室溫（第1次測(cè)定室溫為28℃，第2次測(cè)定室溫為32℃）用力振蕩后，顛倒混勻8-10次立即直接上機(jī)測(cè)定，而后顯微鏡手工計(jì)數(shù)WBC、RBC、PLT也用該管標(biāo)本；1管置37℃水浴10min后立即上機(jī)測(cè)定；1管置換血漿后上機(jī)測(cè)定。置換血漿法參照張時(shí)民[1]和Antiua[2]的富血小板血漿的制備方法：EDTA-K2抗凝標(biāo)本以160g的力離心6min，用100μl Eppendor f移液器插至上清液與交界面上3mm，緩緩將上層血漿取出棄掉，并記錄丟棄的量，再加入等量37℃生理鹽水。然后再加入37℃生理鹽水3-5ml，以160g的力離心6min洗滌標(biāo)本3-5次后，緩緩棄掉等體積多加入的生理鹽水，標(biāo)本再顛倒混勻8～10次后上機(jī)測(cè)定并記錄檢測(cè)參數(shù)：WBC、RBC、PLT、Hct、MCV，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)，平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)。紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)，平均血小板體積(MPV)等。白細(xì)胞分類(lèi)分為：中性粒細(xì)胞(N)、淋巴細(xì)胞(L)、單核細(xì)胞(M)、嗜酸性粒細(xì)胞(E)、嗜堿性粒細(xì)胞(E)。

1.3.2 冷凝集素效價(jià)測(cè)定 抽取患者不抗凝靜脈血2ml，37℃水浴凝固后，迅速分離血清。取血清0.5ml用生理鹽水倍比稀釋后，加等量用生理鹽水洗滌后的3人份混合的5%“O”型紅細(xì)胞懸液混勻，4℃冰箱中 2-4h后觀察結(jié)果[3]。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)結(jié)果 對(duì)于有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)檢標(biāo)本，由表1、表2在四種不同條件下檢測(cè)結(jié)果可知，與傳統(tǒng)的手工分類(lèi)計(jì)數(shù)比較，冷凝集素對(duì)于血液分析儀的白細(xì)胞分類(lèi)、PLT、MPV、Hb影響不大，符合CLIA'88能力驗(yàn)證計(jì)劃的分析質(zhì)量要求[3]；對(duì)血液分析儀的WBC結(jié)果影響較大，且冷凝集素效價(jià)越高影響越大；在直接檢測(cè)法和37℃水浴法中高效價(jià)冷凝集素對(duì)RBC、MCV、MCH、MCHC的檢測(cè)造成嚴(yán)重干擾，且效價(jià)越高影響越嚴(yán)重。高效價(jià)冷凝集素經(jīng)37℃水浴法，不能有效消除冷凝集素的干擾，即使水浴10min后肉眼仍能觀察到有明顯的凝塊(見(jiàn)圖11)。置換血漿法可以有效排除這些干擾，使除PLT、MCV外所有參數(shù)與真值吻合。由于置換過(guò)程會(huì)造成PLT的丟失，故可采用手工計(jì)數(shù)或者直接上機(jī)檢測(cè)的PLT結(jié)果報(bào)告[1]?；颊呤状尉驮\置換血漿后MCV高達(dá)135f L, 是因?yàn)楫?dāng)時(shí)患者的滲透壓高達(dá)328mOsmol/(kg.H2O)，而MCV對(duì)溶液滲透壓非常敏感[4]，紅細(xì)胞經(jīng)等滲透生理鹽水置換、洗滌過(guò)程漲大所致。因標(biāo)本呈果凍樣凝塊，故制備血涂片采用37℃水浴后標(biāo)本(見(jiàn)圖11)和置換血漿后標(biāo)本分別涂片、使用瑞-姬染色，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)(見(jiàn)圖12、13)。兩種方法制片的白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果基本一致，且與用三種上機(jī)檢測(cè)法分類(lèi)結(jié)果一致。

2.2 圖形結(jié)果

2.2.1 散點(diǎn)圖

2.2.1.1 WBC/BASO通道散點(diǎn)圖 直接檢測(cè)法的WBC/BASO通道散點(diǎn)圖的左上區(qū)域出現(xiàn)許多藍(lán)色的散點(diǎn)(見(jiàn)圖1)，是凝集的紅細(xì)胞造成的；水浴法的該區(qū)域散點(diǎn)明顯減少(見(jiàn)圖2)，置換血漿法該區(qū)域散點(diǎn)消失(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明水浴法可以減少冷凝集素對(duì)WBC/BASO通道的干擾，置換血漿法可以消除冷凝集素對(duì)該通道的干擾。

2.2.1.2 IMI通道散點(diǎn)圖 直接檢測(cè)法的IMI通道散點(diǎn)圖的對(duì)角線方向上方,有明顯條帶狀出藍(lán)色的散點(diǎn)(見(jiàn)圖4)，是凝集的紅細(xì)胞造成的干擾；水浴法的該區(qū)域散點(diǎn)明顯減少(見(jiàn)圖5)，置換血漿法該區(qū)域散點(diǎn)消失(見(jiàn)圖6)，說(shuō)明水浴法可以減少冷凝集素對(duì)IMI通道的干擾，置換血漿法可以消除冷凝集素對(duì)該通道的干擾。

2.2.2 直方圖 直接檢測(cè)法的紅細(xì)胞直方圖左側(cè)多出一個(gè)明顯的峰，血小板直方圖峰頂端略左移(見(jiàn)圖7)；水浴法的紅細(xì)胞直方圖左側(cè)多出一個(gè)小峰，但高度較低，血小板直方圖基本正常(見(jiàn)圖8)。置換血漿法紅細(xì)胞直方圖和血小板直方圖均正常(見(jiàn)圖9)

圖1 直接檢測(cè)法BASO通道；圖2 37℃水浴10mi n BASO通道；圖3置換血漿法BASO通道；圖4直接檢測(cè)法IMI通道；圖5 37℃水浴10min IMI通道；圖6 置換血漿法IMI通道；圖7 直接檢測(cè)法直方圖；圖8 37℃水浴10mi n后直方圖；圖9 置換血漿法直方圖。

2.3 報(bào)警提示 直接檢測(cè)法白細(xì)胞報(bào)警提示：Blasts、Imm Gran、Lef t shi f t、NRBC.紅細(xì)胞報(bào)警提示：RBC Abn Dst.RBC Lyse resistance.血小板報(bào)警提示：PLT Clumps；水浴法報(bào)警提示僅有Imm Gran、RBC Lyse resistance、PLT Clumps，其它已消失；置換血漿法各種報(bào)警均消失。

3 討 論

La n d于1 9 1 3年首次對(duì)冷凝集素(c o l d agglutinin，CA)進(jìn)行報(bào)道[5]。大多數(shù)人血清中都存在CA，但其效價(jià)多<1：16，通常不會(huì)導(dǎo)致自身血細(xì)胞的凝集。當(dāng)血液溫度低于某一特定溫度時(shí)，循環(huán)中自身抗體就會(huì)與紅細(xì)胞抗原相結(jié)合。其范圍為4～35℃。冷凝集閾溫度很少高于30℃，通常低于25℃。文中患者第1、2次就診時(shí)的室溫分別為26℃、32℃，血常規(guī)標(biāo)本均出現(xiàn)果凍樣凝塊屬于少見(jiàn)，冷凝集效價(jià)極高大于1:2048，與樂(lè)家新等在30℃以上一般不發(fā)生凝集反應(yīng)，但較高滴度的冷凝集抗體會(huì)導(dǎo)致冷凝集綜合征的觀點(diǎn)基本一致[6]。孟令章也認(rèn)為：通常在室溫很低的情況下，才會(huì)發(fā)生的冷凝集現(xiàn)象，在夏天氣溫較高時(shí)也常有發(fā)生，這些患者的冷凝集素效價(jià)很高，發(fā)生凝集的溫度范圍寬[7]。楊世明等認(rèn)為冷凝集素的凝集能力隨著溫度的升高而降低，低效價(jià)的冷凝集素在37℃其凝集活性可消失，但高效價(jià)的冷凝集素在37℃甚至43℃仍有較強(qiáng)的凝集力[8]。本文探討的就屬于這種情況，其冷凝集素效價(jià)高達(dá)10000以上，標(biāo)本即使經(jīng)過(guò)37℃水浴10min后仍導(dǎo)致RBC和HCT結(jié)果出現(xiàn)很大偏差，且MCH、MCHC的值與正常參考值極度偏離。

圖10 標(biāo)本呈果凍樣凝固；

圖11 37℃水浴10min后仍有凝塊；

圖12 37℃水浴10min后推片；

圖13 置換血漿后推片。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于高效價(jià)冷凝集素標(biāo)本經(jīng)37℃水浴法無(wú)法有效消除冷凝集素的干擾，即使水浴10min后肉眼仍能觀察到明顯的凝集塊(見(jiàn)圖11)。為此我們參照富血小板血漿的制備方法，進(jìn)行置換血漿。標(biāo)本以160 g的力離心6 min，離心后分為3層，底部為約占55%體積的紅細(xì)胞；中間層為占5%體積的血小板濃縮物(platelet concent rate，PC)。頂部為約40%體積的貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，主要是纖維蛋白原等血漿成分。用100μl Eppendor f移液器插至上清液與交界面上3mm，緩緩將上層血漿取出棄掉，并記錄丟棄的量，再加入等量37℃0.9%生理鹽水。然后再加入37℃0.9%生理鹽水3-5ml，以160g的力離心6min洗滌標(biāo)本3-5次后，緩緩棄掉多加入的生理鹽水。經(jīng)過(guò)置換血漿后，除因置換過(guò)程中造成血小板部分丟失外其它參數(shù)與手工法檢測(cè)的結(jié)果基本一致?？梢?jiàn)，置換血漿法是有效消除高效價(jià)冷凝集干擾血常規(guī)檢測(cè)的好方法。

表1 首次就診時(shí)用四種方法檢測(cè)有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)標(biāo)本結(jié)果

表2 再次就診時(shí)用四種方法檢測(cè)有高效價(jià)冷凝集素的血常規(guī)標(biāo)本結(jié)果

直接檢測(cè)法和水浴法RBC和HCT結(jié)果均顯著降低， MCH和MCHC結(jié)果均顯著增高，MCV變化不大。這種現(xiàn)象是由于冷凝集素使紅細(xì)胞凝集.導(dǎo)致RBC計(jì)數(shù)降低。因此，HCT(HCT=RBC×MCV)結(jié)果仍然降低.并由此造成MCH(MCH=HGB／RBC)、MCHC(MCHC=HGB／HCT)的計(jì)算值顯著升高。

直接檢測(cè)法和水浴法白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與手工計(jì)數(shù)法相比明顯偏高，這可能是由于有極高效價(jià)冷凝集素的標(biāo)本，緊密凝集的紅細(xì)胞，在儀器特定的時(shí)間內(nèi)不能被溶血?jiǎng)┩耆芙?。雖Sysmex XE-2100血細(xì)胞分析儀在白細(xì)胞計(jì)數(shù)上采用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)，采用兩個(gè)通道進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)?？捎行У呐懦蓴_準(zhǔn)確計(jì)數(shù)分類(lèi)，但是緊密凝集的紅細(xì)胞，在儀器特定的時(shí)間內(nèi)不能被溶血?jiǎng)┩耆芙?，即便是在溶血能力特別強(qiáng)的WBC/BASO通道中STROMATOLYSER可將絕大多數(shù)、甚至有一定抵抗能力的異常紅細(xì)胞、血小板處理后呈淡影化，但對(duì)于緊密凝集的紅細(xì)胞卻無(wú)法完全溶解，造成白細(xì)胞計(jì)數(shù)略偏高，并在BASO通道散點(diǎn)圖上表現(xiàn)出來(lái)(見(jiàn)圖1)。

首次就診時(shí)，置換血漿法中MCV為135f L明顯大于其它兩種檢測(cè)法，可能是由于患者的血漿滲透壓高造成的。紅細(xì)胞膜是一種選擇性濾過(guò)膜 ,當(dāng)血漿滲透壓增高 ,紅細(xì)胞處于相對(duì)高滲環(huán)境,此時(shí)紅細(xì)胞略微皺縮;而置換血漿用的0.9%生理鹽水是一種等滲溶液,它能保持細(xì)胞的生物學(xué)特性及形態(tài)完整性。當(dāng)高滲血樣在置換過(guò)程中與0.9%生理鹽水接觸時(shí),由于滲透壓變低紅細(xì)胞腫脹,紅細(xì)胞體積增大,造成儀器測(cè)定時(shí)MCV假性增高[9]。

在進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)時(shí)對(duì)于冷凝集現(xiàn)象，有些標(biāo)本的冷凝集現(xiàn)象肉眼可見(jiàn)，而有的則無(wú)法用肉眼觀察到，前者如本文中的標(biāo)本有明顯凝塊，很容易發(fā)現(xiàn)，但對(duì)后者如何才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)、識(shí)別呢？可以利用下述規(guī)律：一般正常人Hb/RBC的比值約為30：1，Hb的單位為g／L，RBC的單位為1012／L[10]。如果血常規(guī)結(jié)果中Hb/RBC比例較高，比30大很多，且MCH、MCHC的結(jié)果異常升高（如本文MCH為196，MCHC為1719）。則提示有可能是冷凝集現(xiàn)象。

綜上所述，我們?cè)谶M(jìn)行血細(xì)胞分析樣本時(shí)，應(yīng)仔細(xì)觀察樣本，在審核報(bào)告單時(shí)，除了重點(diǎn)審查WBC、RBC、Hb主要指標(biāo)外，千萬(wàn)不要放過(guò)MCH、MCHC，尤其是MCHC，往往能幫助我們發(fā)現(xiàn)比較嚴(yán)重的錯(cuò)誤。另外，有冷凝集現(xiàn)象時(shí)在散點(diǎn)圖、直方圖上也會(huì)表現(xiàn)出來(lái)，因此，發(fā)現(xiàn)散點(diǎn)圖、直方圖異常時(shí)，也應(yīng)查明原因，排除干擾，防止發(fā)出錯(cuò)誤的檢驗(yàn)報(bào)告，影響臨床診斷治療。

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Influence Investigation of High Titer Cold Agglutinin on Hematology Analysis and its Eliminate Measures

ZENG Ling-jun, LI-li, Wu qing，et al.Department of Clinical Laboratory，Anhui Provincial Hospital，Anhui Hefei 230001，China

ObjectiveTo investigate the effect of high titer cold agglutinin on hematology analysis and its eliminate measures.Methods The specimen of the high titer cold agglutinin was tested respectively with 37℃water bath in front and back, and exchange plasma by the Sysmex XE-2100 and the results were analyzed.Results In 37℃water bath in front and back The hematology analyzer can be displayed the most parameters is incorrectness except PLT、Hb、MPV and leukocyte differential count.Particularly, the results of RBC、MCH、MCHC showed significant difference between 37℃water bath in front or back and in fact.The hematology analyzer also can be displayed the abnormal scatter and histogram for WBC、RBC、 PLT and gave corresponding alarm.The other way round, the results of exchange plasma can be displayed the most results is correctness except PLT, The corresponding alarm were disappeared.ConclusionThe specimen of the high titer cold agglutinin has significantly effect on results of sysmex XE-2100 hematology analyzer.In 37℃water bath in front and back can’t eliminate the effect except Hb、MPV and leukocyte differential count.Therefore the suspected cold hemagglutination specimen should be exchange plasma to eliminate the effect and tested again.If the PLT lost more, you can use the result of direct tested.

high titer；cold agglutinin；routine blood test；exchange plasma

R466.111

A

10.3969/j.issn.1009-3257.2011.05.001

曾令軍 ,男,主管檢驗(yàn)師,主要研究方向?yàn)榕R床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。

2011-06-06