DIGFA-kit和IEST檢測(cè)人、鼠斯氏貍殖吸蟲抗體的研究*

朱名勝,朱 敬,王紹基,宋明華

斯氏貍殖吸蟲病(Pagunogonimiasis skrjabini)的病原體為斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimus skrjabini),是在中國(guó)廣泛分布,危害嚴(yán)重的食源性寄生蟲病。湖北省十堰市曾在蟹體內(nèi)查出斯氏貍殖吸蟲囊蚴,在貓、犬體內(nèi)也檢出過(guò)斯氏貍殖吸蟲成蟲[1],因當(dāng)?shù)鼐用裼酗嬌褪成返牧?xí)慣,斯氏肺吸蟲病病人時(shí)有發(fā)現(xiàn)[2]。由于人體為該蟲的非正常宿主,感染后導(dǎo)致“幼蟲移行癥”引起多組織、器官的損害,嚴(yán)重危害其身體健康[3-4],該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,常被誤診、誤治。為了探索較簡(jiǎn)易的血清學(xué)診斷方法,作者采用肺吸蟲病金標(biāo)滲濾試劑盒(DIGFA-kit)和免疫酶染色試驗(yàn)(IEST)對(duì)流行區(qū)人群和斯氏貍殖吸蟲感染鼠血清進(jìn)行特異性抗體檢測(cè),比較二者的敏感性和特異性。

1 材料與方法

1.1 試劑盒 肺吸蟲病抗體快速檢測(cè)(金標(biāo)滲濾法)試劑盒(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)。

1.2 血清樣本 斯氏貍殖吸蟲病流行區(qū)湖北省十堰市居民血清1 062份,感染斯氏貍殖吸蟲90d大鼠血清40份(每鼠感染囊蚴30個(gè)),感染旋毛蟲50d大鼠血清34份,感染日本血吸蟲40d家兔血清30份,蛔蟲病人血清28份,健康大鼠血清40份。其中40只實(shí)驗(yàn)大鼠感染后每周心臟穿刺取血1次,分離血清備用。

1.3 冰凍切片抗原制備 剖殺經(jīng)人工感染斯氏貍殖吸蟲 3個(gè)月的犬,從肺蟲囊中收集成蟲,用0.01mol/L pH7.4 PBS(含 0.05%Tween20)沖洗后,冰凍切片,厚度 6μ m,每張載玻片裱貼5塊抗原片,經(jīng)丙酮固定后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DIGFA 取試劑盒置一平面上,加洗脫液1滴(100μL),使加樣孔上 NC 膜濕潤(rùn);加待檢血清25μL,待滲入;加洗脫液 1 滴(100μL),洗去未結(jié)合抗體;加膠體金-羊抗人IgG標(biāo)記物1滴(100μL),待滲入;加洗脫液2滴(200μL),滲入后肉眼判斷結(jié)果。中央圓孔NC膜上出現(xiàn)了紅色圓點(diǎn)為陽(yáng)性;未出現(xiàn)紅色圓點(diǎn),僅留白色或淡紅色背景為陰性。

1.4.2 IEST 將測(cè)試血清用0.01mol/L pH7.4 PBS分別作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋,分別取1滴滴于斯氏貍殖吸蟲成蟲冰凍切片上,置濕盒中35℃孵育60min,用0.01mol/L pH7.4 PBS洗滌3次,每次5min,吹干。滴加酶標(biāo)葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA,北京生物制品研究所產(chǎn)品,工作濃度1∶20),同上培育洗滌。再加底物溶液(3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽-過(guò)氧化氫),室溫反應(yīng)15～20min,棄底物,用蒸餾水速洗,將濕片置光鏡下觀察反應(yīng)。結(jié)果判定:抗原片不著色為(-);呈淡棕色為(+);棕色為(++);棕褐色為(+++)。陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)定為血清稀釋度≥1∶10(+)。

2 結(jié) 果

2.1 特異性 斯氏貍殖吸蟲流行區(qū)人群及斯氏貍殖吸蟲病鼠血清DIGFA和IEST的陽(yáng)性檢出率均為5.08%和100%,其它對(duì)照血清除1例血吸蟲病兔DIGFA出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)外,均為陰性(表1)。

2.2 敏感性 40只大鼠感染后不同時(shí)間二種方法檢測(cè)結(jié)果見表2,二種方法感染后第1周血清抗體均為陰性,從第2周開始出現(xiàn)陽(yáng)性,第4周陽(yáng)性率達(dá)100%,持續(xù)至第 8周。

表1 DIGFA和IEST檢測(cè)血清斯氏貍殖吸蟲抗體結(jié)果Table 1 Result of detection for antibody test of human in endemic area and animals with different parasitic diseases by DIGFA and IEST

表2 大鼠感染斯氏貍殖吸蟲后血清抗體檢測(cè)結(jié)果(DIGFA和IEST)Table 2 Results of detection for antibody in serafrombig rats infected with Pagumogonimus skrjabini

3 討 論

斯氏貍殖吸蟲是一種人獸共患寄生蟲,一般在人體內(nèi)不能發(fā)育為成蟲,病原學(xué)診斷較為困難。免疫學(xué)診斷常用的方法主要是皮內(nèi)試驗(yàn),皮內(nèi)試驗(yàn)方便、快速,但具有一定的交叉反應(yīng),特異性不強(qiáng)。滴金免疫(金標(biāo))滲濾法(DIGFA)是一種新近發(fā)展起來(lái)的免疫標(biāo)記技術(shù),近年來(lái)報(bào)道應(yīng)用衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲抗原(PwA)金標(biāo)滲濾試劑盒(DIGFA)檢測(cè)同源肺吸蟲病病人血清抗體敏感性可達(dá)98.8%和98.9%,特異性可達(dá)93.0%和94.8%[5-6],證明應(yīng)用于衛(wèi)氏肺吸蟲病流行地區(qū)具有敏感性高,特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便、快速,不需要特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn),適用于臨床檢驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。湖北省十堰地區(qū)為斯氏肺吸蟲病流行地區(qū),本次用DIGFA和IEST檢測(cè)流行區(qū)居民和病鼠血清抗體,陽(yáng)性率均為5.08%和100%。表明這兩種方法用于斯氏肺吸蟲病的檢測(cè)均具有較好的敏感性和特異性,在斯氏肺吸蟲病抗體的檢測(cè)中,不僅為較好的手段,而且這兩種方法彼此間檢測(cè)結(jié)果呈較好的一致性,并均具有早期診斷價(jià)值。

李調(diào)英等[7]報(bào)道衛(wèi)氏肺吸蟲成蟲抗原(PwA)和斯氏貍殖吸蟲成蟲抗原(PsA)對(duì)同源及異源肺吸蟲病人血清反應(yīng)都有較好的敏感性和特異性。作者應(yīng)用PwA抗原制備的DIGFA試劑盒檢測(cè)斯氏貍殖吸蟲病流行地區(qū)人群血清,斯氏肺吸蟲大鼠血清和其它對(duì)照血清,檢測(cè)結(jié)果與IEST試驗(yàn)結(jié)果基本一致。說(shuō)明Pw和Ps有很多共同的特異抗原組份,決定了它們能與異源肺吸蟲病人血清IgG有效的特異結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺吸蟲病DIGFA診斷試劑盒和IEST用于斯氏肺吸蟲病血清學(xué)檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性和特異性較好,結(jié)果易于判斷等優(yōu)點(diǎn)。因此,在斯氏肺吸蟲病流行地區(qū)進(jìn)行臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查時(shí),可選用其中一種方法,作為病原學(xué)診斷的替代方法,上述二種血清學(xué)試驗(yàn)方法均具有較大的實(shí)用價(jià)值。

[1]張光玉,郭鄂平.十堰地區(qū)肺吸蟲病區(qū)域分布及流行病學(xué)[J].鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,16(1):23.

[2]朱名勝,朱丹.斯氏肺吸蟲病 108例臨床報(bào)告[J].四川醫(yī)學(xué),2004,25(12):1321.

[3]郭鄂平,朱潔,張光玉,等.斯氏貍殖吸蟲病53例臨床資料分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(2):147-149.

[4]Nakamura-uchiyama F,Onah DN,Naway MV.Clinical features of paragonimiasis cases recently found in Japan:parasite-specific immunogobulin M and G antibody classes[J].Clin Infect Dis,2001,32(2):171-175.

[5]干小仙,施曉華,王越,等.肺吸蟲病抗體快速檢測(cè)試劑盒(金標(biāo)滲濾法)的研制和應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2005,21(11):988-990.

[6]丁建祖,王越,陳軍虎,等.斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測(cè)肺吸蟲抗體的評(píng)價(jià)[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2003,19(1):89-90.

[7]李調(diào)英,徐亮,曾明安.衛(wèi)氏和斯氏肺吸蟲抗原對(duì)同源及異源肺吸蟲病診斷價(jià)值的比較[J].實(shí)用寄生蟲病雜志,2000,6(2):86-87.