HPLC-ELSD測定益氣養(yǎng)血口服液中黃芪甲苷的含量

武子敬，孫仁爽，沈笑媛，冉 靚

（1．通化師范學(xué)院，吉林通化 134002；2．上海蘇豪逸明制藥有限公司，上海 200333；3．貴陽學(xué)院，貴州貴陽 550005）

益氣養(yǎng)血口服液是中國藥典收錄的中成藥，方中含有人參、黨參、黃芪、陳皮、當(dāng)歸、白術(shù)、五味子等共13味藥。具有益氣養(yǎng)血的功效，用于氣血不足所致的氣短心悸、面色不華、體虛乏力[1]。其中黃芪是主藥之一，黃芪的主要成分有黃芪多糖（APS）、單糖、黃酮、生物堿（膽堿、甜菜堿）、葉酸、多種氨基酸、葡萄糖醛酸、苦味素及硒、硅等多種微量元素[2]，其中主要活性成分為黃芪多糖和黃芪甲苷[3]。

依據(jù)藥典中原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，測定黃芪甲苷的含量采用薄層掃描法。薄層掃描法是把被測樣品經(jīng)薄層板分離后，用薄層掃描儀在樣品特定吸收波長處掃描，利用儀器測量透過斑點或被斑點反射的光束強度的變化來進行定量分析[4]。中藥復(fù)方制劑中黃芪甲苷含量的測定并不適合采用薄層掃描法[5]，因為存在檢測周期長、重現(xiàn)性差、不穩(wěn)定的缺點。該試驗采用高效液相色譜–蒸發(fā)光散射檢測法[6]（Highperformance liquid chromatography–evaporative light-scattering detection，HPLC–ELSD）檢測益氣養(yǎng)血口服液中黃芪甲苷的含量，操作簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，為益氣養(yǎng)血口服液的質(zhì)量控制提供了新方法。

1 儀器與試藥

美國Agilentl2000高效液相色譜儀；蒸發(fā)光散射檢測器；KQ-500型超聲波清洗機。

黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110781-200613）；純凈水；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。供試品：益氣養(yǎng)血口服液（批號 20090806）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentlTc-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈–水（35︰65）；檢測器：蒸發(fā)光散射器檢測器；柱溫35℃，漂移管溫度60℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對照品4.06 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并加至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取益氣養(yǎng)血口服液樣品15 mL，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇溶液25 mL，振搖提取3次，合并正丁醇液，再用氨試液充分洗滌2次，每次25 mL。棄去氨液，再用水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，取正丁醇層，置水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.4 陰性對照品的制備

取缺少黃芪的處方藥材，按制備工藝制成陰性制劑，依“2.3”項的方法制成供試液，作為陰性對照品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

分別取黃芪甲苷對照品溶液、益氣養(yǎng)血口服液供試品溶液和缺黃芪的陰性對照品溶液各10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項所述對照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 置 1 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。取以上溶液各10μL分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖。以峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)，以對照品濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)作線性回歸，得回歸方程為Y=1.522X+4.97，R=0.999 7，線性范圍 4.06～8.12 μg。

2.7 精密度試驗

取同一供試品溶液，在選定的色譜條件下，依法操作測定，重復(fù)進樣5次，每次進樣10μL。以峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation[7]，RSD）為1.17%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h后，依法操作測定。以峰面積計算RSD為1.11%。

2.9 重現(xiàn)性試驗

取相同批號樣品6份，制備供試品溶液，依法操作測定。將測得數(shù)據(jù)代入“2.6”項的回歸方程中，計算黃芪甲苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.126 2 mg/mL，其RSD為1.18%。

2.1 0 回收率試驗

采用加樣加收法，精密稱取同一批號樣品適量，分別加入黃芪甲苷對照品溶液0.4 mL，照“2.3”項下方法制成供試品溶液，分別進樣10μL，按上述色譜條件測定黃芪甲苷的含量，計算加樣加收率。結(jié)果表明，該方法的平均回收率為96.44%，RSD為1.24%（n=6）。

3 結(jié)果分析

對比供試品溶液和對照品溶液的色譜圖，可見黃芪甲苷的峰峰形對稱；對比對照品溶液和陰性對照品溶液的色譜圖，可見黃芪甲苷的峰與益氣養(yǎng)血口服液方中其他成分的峰區(qū)分明顯。所以，采用HPLC–ELSD測定益氣養(yǎng)血口服液中黃芪甲苷的含量，其結(jié)果不會受到方中其他成分的干擾。

由加樣加收法測定回收率試驗，回收率大于95%，RSD較小，說明該試驗可行。

線性回歸分析結(jié)果表明，色譜圖中黃芪甲苷峰面積與其含量的線性關(guān)系良好。

分析精密度試驗、穩(wěn)定性試驗和重現(xiàn)性試驗結(jié)果，可以看出RSD都比較小，說明該方法在精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性方面皆有理想表現(xiàn)。

4 討論

目前在2005版《中國藥典》收載的含黃芪的中成藥中，只有部分采用HPLC–ELSD法來測定黃芪甲苷含量。益氣養(yǎng)血口服液中黃芪為主藥，復(fù)方成分多，藥典中采用薄層色譜法對其黃芪甲苷含量進行測定，操作步驟繁瑣費時[8]，測定不穩(wěn)定，重現(xiàn)性不理想。本試驗首次建立了用HPLC–ELSD法測定該口服液中黃芪甲苷的含量，經(jīng)過對線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等進行方法學(xué)考察，證明該方法操作簡便，準(zhǔn)確可行，選用該文方法進行試驗，可以達到生產(chǎn)過程準(zhǔn)確控制的要求。

[1]國家藥典委員會．中國藥典[S]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005：574．

[2]王俊輝,孫志良．黃芪的有效成分及在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]．飼料研究,2006(12):19－21．

[3]朱虹云,徐文崢,劉帥英．HPLC–ELSD法測定補血顆粒中黃芪甲苷[J]．中草藥,2009,40(8):1247－1249．

[4]羅由萍,鄧鵬飛．薄層色譜及其在藥用植物研究中的應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(6):3309－3312．

[5]陳玉杰,金紅星,李萍,等．基于HPLC–ELSD法的中藥復(fù)方制劑中黃芪甲苷含量測定[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(35):17304－17305．

[6]曾慶華,張莉莉,孫小凡,等．HPLC–ELSD法測定芒果中的果糖、葡萄糖和蔗糖[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(18):9781－9783．

[7]Dodge Y．The Oxford Dictionary of Statistical Terms[M]．Oxford：Oxford University Press,2003．

[8]張玉東,徐士云．益氣養(yǎng)血口服液中黃芪的薄層色譜鑒別法探討[J]．中成藥,2007,29(10):1560－1561．