抗菌肽對(duì)蛋雞血清免疫指標(biāo)及脾臟白細(xì)胞介素2 mRNA 表達(dá)量的影響

呂尊周 袁肖笑 蔡兆偉 尹兆正

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310029)

抗菌肽(AMPs)是一類(lèi)小于100個(gè)氨基酸的小分子多肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，其具有廣譜的抗菌活性，是生物體先天免疫系統(tǒng)的組成成分。抗菌肽具有不同于抗生素的作用特點(diǎn)，不易產(chǎn)生耐藥性，是今后替代抗生素的理想飼料添加劑之一，在畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類(lèi)已達(dá)上千種，但由于抗菌肽的來(lái)源問(wèn)題以及作用機(jī)制不明確，可作為飼料添加劑的抗菌肽種類(lèi)較少。已有研究表明，飼糧中添加抗菌肽對(duì)肉雞、肉鴨和斷奶仔豬均具有促生長(zhǎng)的作用［1－3］。在免疫方面，飼喂動(dòng)物腸道來(lái)源的抗菌肽可以提高雛雞的體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫功能［4－6］。但目前關(guān)于抗菌肽在蛋雞產(chǎn)蛋階段的研究還鮮有報(bào)道。作者在前期的飼養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌抗菌肽能改善蛋雞的產(chǎn)蛋性能。因此，本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究不同水平抗菌肽對(duì)蛋雞免疫功能的影響，通過(guò)對(duì)蛋雞脾臟系數(shù)、血清免疫指標(biāo)以及脾臟白細(xì)胞介素2(IL-2)mRNA表達(dá)量的測(cè)定分析，初步探討抗菌肽對(duì)機(jī)體免疫調(diào)控的作用機(jī)制，為今后在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物為30周齡海塞克斯褐殼蛋雞。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧在參照美國(guó)NRC(1994)蛋雞營(yíng)養(yǎng)需要量的基礎(chǔ)上，結(jié)合海塞克斯蛋雞飼養(yǎng)手冊(cè)配制而成(表1)。試驗(yàn)用抗菌肽由杭州保安康生物技術(shù)有限公司提供(枯草芽孢桿菌天然抗菌肽，有效含量1%)，由37個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為3～5 ku。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇480只30周齡、體重及產(chǎn)蛋率基本一致的海塞克斯褐殼商品蛋雞，隨機(jī)分成4個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只雞。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧;Ⅱ～Ⅳ組為試驗(yàn)組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加200、400、600 mg/kg抗菌肽。預(yù)試期7 d，正試期28 d。采用4層階梯式籠養(yǎng)，自由采食及飲水，光照16 h，免疫程序按常規(guī)進(jìn)行。

1.3 屠宰及樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束最后1 d，每組隨機(jī)選取12只雞(每個(gè)重復(fù)3只)空腹稱(chēng)重，頸動(dòng)脈放血、自然析出血清，離心后分裝，－20℃保存待測(cè)。采集脾臟，迅速稱(chēng)重后剪成小塊，液氮中速凍，－70℃保存。

1.4 脾臟系數(shù)測(cè)定

屠宰雞全部測(cè)定脾臟系數(shù)。

脾臟系數(shù)(g/kg)=脾臟重(g)/活重(kg)。

1.5 血清免疫指標(biāo)測(cè)定

每組隨機(jī)取8個(gè)樣本測(cè)定血清免疫指標(biāo)，血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體3(C3)和補(bǔ)體4(C4)含量采用免疫比濁法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，分析儀器為Rx Daytona全自動(dòng)生化分析儀。

1.6 脾臟IL-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

1.6.1 總RNA的提取和cDNA的合成

每組隨機(jī)取8個(gè)樣本提取總RNA，RNA提取所用的試管、器皿、槍頭均用0.1%焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水處理過(guò)夜后，高壓滅菌。提取步驟按照RNA prep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說(shuō)明進(jìn)行。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

取1 μg總RNA按照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.6.2 引物的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GenBank上公布的雞的IL-2基因mRNA序列，使用Primer 3.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物序列參照Higgs等［7］設(shè)計(jì)。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立和IL-2 mRNA熒光定量PCR檢測(cè)

隨機(jī)取一個(gè) cDNA樣本，取2 μL，依次10倍梯度稀釋獲得 1 ×10－1、1 ×10－2、1 ×10－3、1 ×10－4濃度的稀釋產(chǎn)物。以稀釋的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，每個(gè)稀釋濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用SYBR GreenⅠ染料法在ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，加 dH2O 至 20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃變性 5 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，判定引物的特異性。采用上述反應(yīng)體系和條件對(duì)各樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。

表2 引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequences and parameters

1.7 數(shù)據(jù)分析

目的基因相對(duì)表達(dá)量按以下公式計(jì)算:

式中:Ct為閾值循環(huán)。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，各組間平均值的比較采用LSD多重比較進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn)，以P＜0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽對(duì)蛋雞脾臟系數(shù)的影響

由表3可知，抗菌肽能不同程度地提高蛋雞的脾臟系數(shù)。與對(duì)照組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組蛋雞脾臟系數(shù)分別提高了 11.54%(P ＞0.05)、27.99(P ＜0.05)、11.65%(P ＞0.05)。

表3 抗菌肽對(duì)蛋雞脾臟系數(shù)的影響Table 3 Effects of AMPs on spleen coefficient of laying hens

2.2 抗菌肽對(duì)蛋雞血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，添加抗菌肽能不同程度地提高蛋雞的血清免疫水平。抗菌肽組IgA 含量分別提高了 7.69%(P ＞0.05)、19.40%(P ＜0.05)和 14.38%(P ＞0.05)，IgG 含量分別提高了 12.69%(P ＞ 0.05)、21.24%(P ＜ 0.05)和 9.10%(P ＞0.05)，IgM 含量分別提高了3.12%(P ＞0.05)、7.23%(P ＞ 0.05)和 13.6%(P＞0.05)，C3含量分別提高了 12.12%(P ＞0.05)、11.85%(P ＞ 0.05)和 15.56%(P ＞0.05)，但抗菌肽的添加對(duì)C4含量并沒(méi)有顯著影響(P ＞0.05)。

表4 抗菌肽對(duì)蛋雞血清免疫指標(biāo)的影響Table 4 Effects of AMPs on serum Immune indices of laying hens g/L

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)分析

用ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀建立目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并檢驗(yàn)引物的特異性。由圖1和圖2可知，IL-2和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性擬合較好，兩者擴(kuò)增效率相差5%以?xún)?nèi)。2－△△Ct法是一種在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的最簡(jiǎn)便的方法，但使用的前提是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本相同，本試驗(yàn)的擴(kuò)增效率符合這一要求，可以使用該方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析表明，熔解曲線(xiàn)平穩(wěn)且峰形單一，說(shuō)明無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物形成。

圖1 IL-2 cDNA片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(A)和熔解曲線(xiàn)(B)Fig.1 Real-time quantitative PCR standard curves(A)and melt curves(B)of IL-2 cDNA fragment

圖2 β-actin cDNA片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(C)和熔解曲線(xiàn)(D)Fig.2 Real-time quantitative PCR standard curves(C)and melt curves(D)of β-actin cDNA fragment

2.4 抗菌肽對(duì)蛋雞脾臟IL-2 mRNA表達(dá)量的影響

由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組能顯著提高脾臟中IL-2 mRNA的表達(dá)量(P＜0.05)，而Ⅳ組雖有一定程度的提高(P＞0.05)，但表達(dá)量在抗菌肽組中為最低。

3 討論

脾臟是禽類(lèi)重要的外周免疫器官，是免疫應(yīng)答以及抗體產(chǎn)生的主要器官。免疫器官重量是反映免疫器官功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。馬衛(wèi)明［8］研究表明，豬小腸抗菌肽能顯著提高雛雞脾臟、胸腺和法氏囊指數(shù)。楊玉榮等［9］報(bào)道，鴕鳥(niǎo)皮膚抗菌肽能顯著提高4～7日齡雛雞的免疫器官指數(shù)，對(duì)其他日齡雞免疫器官影響不顯著。但也有研究表明抗菌肽對(duì)肉鴨或肉雞的免疫器官并無(wú)顯著影響［10－11］。研究結(jié)果不同的原因可能是選用的抗菌肽種類(lèi)以及動(dòng)物品種不同所致。本研究表明，添加抗菌肽后蛋雞的脾臟指數(shù)有不同程度的提高，其中400 mg/kg組顯著提高。但添加高劑量的抗菌肽時(shí)，脾臟指數(shù)有下降的趨勢(shì)，表明脾臟對(duì)抗菌肽有一定的耐受范圍，過(guò)高劑量有可能抑制免疫器官的發(fā)育，至于抗菌肽如何影響免疫器官發(fā)育尚有待進(jìn)一步的探討。

圖3 抗菌肽對(duì)蛋雞脾臟IL-2 mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of AMPs on expression of IL-2 mRNA in spleen of laying hens

免疫球蛋白是機(jī)體對(duì)抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物，具有各種免疫功能。補(bǔ)體是存在于血清中不耐熱具有酶活性的球蛋白，激活后具有細(xì)胞溶解、細(xì)胞黏附、調(diào)理、免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、中和病毒等重要的生物學(xué)效應(yīng)?？咕氖求w內(nèi)防御體系重要的組成成分，研究表明，用人的α－防御素注射小鼠14 d后其血清中免疫球蛋白G1(IgG1)、免疫球蛋白G2a(IgG2a)、免疫球蛋白G2b(IgG2b)含量顯著升高［12］。Yang 等［4］報(bào)道，1日齡雛雞飼喂雞小腸抗菌肽后，血清IgG和IgM的含量分別在第4～10天和第10～17天顯著提高，其特異性免疫也得到加強(qiáng)。姚俊等［13］研究發(fā)現(xiàn)無(wú)特定病原體(SPF)雞肌肉注射豬腸道抗菌肽后能顯著增加各段腸道內(nèi)杯狀細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)各腸段分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分泌量也顯著增加，說(shuō)明豬小腸抗菌肽能提高腸道黏膜的免疫功能。本研究與上述研究結(jié)果基本一致，所選用的枯草芽孢桿菌抗菌肽也具有類(lèi)似的免疫增強(qiáng)效果，蛋雞血清中IgA、IgG、IgM和C3含量均有一定程度的提高，其中400 mg/kg抗菌肽能顯著提高IgA和IgG的含量，但補(bǔ)體C4的含量有一定的降低，但不顯著。作者在前期的飼養(yǎng)試驗(yàn)中對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)400 mg/kg組能顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，而另外2個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組差異并不顯著，同時(shí)抗菌肽有提高平均蛋重的趨勢(shì)，但差異并不顯著。這說(shuō)明上述免疫指標(biāo)的改變并未影響蛋雞的生產(chǎn)性能。

Tani等［12］報(bào)道，體外培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞用人的的α－防御素刺激后能增殖并促進(jìn)細(xì)胞因子干擾素γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(IL-4)的分泌。在對(duì)人類(lèi)防御素研究中發(fā)現(xiàn)，人抗菌肽LL-37能通過(guò)受體依賴(lài)機(jī)制刺激先天性免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)［14］，并能夠協(xié)同 IL-1β提高人外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)和趨化因子的產(chǎn)生［15］。但 Hancock 等［16］認(rèn)為抗菌肽除了可以直接在溶菌酶協(xié)助下殺死微生物，還在細(xì)胞介素反應(yīng)中扮演反饋調(diào)節(jié)的作用，例如昆蟲(chóng)抗菌肽CEMA能夠抑制RAW細(xì)胞中白細(xì)胞介素15(IL-15)的表達(dá)。目前，抗菌肽對(duì)蛋雞脾臟IL-2 mRNA表達(dá)量的影響還鮮有報(bào)道。IL-2對(duì)于機(jī)體的免疫應(yīng)答起著重要的作用，IL-2主要有輔助性 T細(xì)胞1(Th1)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)以及自然殺傷細(xì)胞(NK)產(chǎn)生，它能促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞因子的形成，增強(qiáng)Tc、NK和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)活性，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體生成。本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能促進(jìn)雞脾臟IL-2 mRNA的表達(dá)量，其中200和400 mg/kg抗菌肽組能顯著提高其表達(dá)量，但600 mg/kg組與400 mg/kg組相比，脾臟IL-2 mRNA的表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，這與本試驗(yàn)中蛋雞脾臟系數(shù)以及血清免疫球蛋白的變化具有一致性，說(shuō)明高劑量的抗菌肽有可能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生免疫抑制作用，這有可能是抗菌肽在細(xì)胞介素的反應(yīng)中存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用導(dǎo)致對(duì)免疫的負(fù)向調(diào)節(jié)。作者推測(cè)，抗菌肽可能通過(guò)促進(jìn)脾臟中IL-2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)抗體的生成，從而提高了血清中抗體的含量，而高劑量的抗菌肽由于負(fù)反饋的調(diào)節(jié)使得抗體含量下降。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加抗菌肽能不同程度地提高蛋雞的脾臟系數(shù)，調(diào)節(jié)血清免疫水平，200和400 mg/kg抗菌肽添加水平能顯著促進(jìn)脾臟IL-2 mRNA的表達(dá)量。綜合本試驗(yàn)結(jié)果，飼糧中以添加400 mg/kg抗菌肽對(duì)蛋雞的免疫效果為最佳。

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