第二信使環(huán)腺苷二磷酸核糖介導Ca2+釋放的作用機制

李雪吟馮 琳，2，3劉 揚，2姜 俊，2周小秋，2，3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學魚類營養(yǎng)與安全生產(chǎn)四川省高校重點實驗室，雅安 625014;3.四川農(nóng)業(yè)大學動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，雅安 625014)

1989年，Lee等［1］在觀察海膽受精過程中發(fā)現(xiàn)，精卵結合導致輔酶Ⅰ(NAD+)分解產(chǎn)生的環(huán)腺苷二磷酸核糖(cADPR)可激活相關鈣庫的離子通道。cADPR是多種細胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+濃度的第二信使［2－3］。一系列的生理刺激都會引起胞內(nèi)cADPR濃度的改變，cADPR通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))上蘭尼堿受體(RyR)通道，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(肌漿網(wǎng))內(nèi)儲存的 Ca2+釋放到細胞質(zhì)內(nèi)［3－4］。cADPR可以在神經(jīng)細胞、肌肉細胞和T淋巴細胞等多種細胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+濃度，從而刺激神經(jīng)細胞增殖分化［5］、介導肌細胞收縮［2，4］和激活 T 淋巴細胞［3］。本文主要對cADPR的合成方式及其在細胞內(nèi)介導Ca2+釋放的作用機制做一綜述。

1 cADPR的化學結構

cADPR是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸分解產(chǎn)生，腺苷酸的N1位與核糖 C1″、腺苷酸N9位與核糖C1'分別以β構象相連，形成環(huán)化結構，同時腺苷酸上N6與C6位單鍵變?yōu)殡p鍵，從而增強了其活性。cADPR是由NAD+水解后的長鏈分子形成的頭尾相連的環(huán)化結構，因此它在室溫下比較穩(wěn)定［6］。核糖的主要作用是通過其上的氧原子連接腺嘌呤與磷酸。研究表明，當用甲基取代C1″位氧原子后，cADPR失去活性，但即使用醚鍵取代核糖，cADPR 仍能引起 Ca2+的釋放［7］。

2 cADPR的合成途徑

在哺乳動物上，cADPR的合成是以β-NAD+為底物，由 CD38 酶催化產(chǎn)生［2，4］。CD38 是一種跨膜糖蛋白，活性中心位于胞外，6個不變氨基酸殘基在活性中心形成口袋狀結構，使NAD+和輔酶Ⅱ(NADP)能夠和活性部位嵌合，使長鏈分子折疊，首尾相連形成環(huán)化結構，10個高度保守的半胱氨酸殘基使二硫鍵位置固定，從而維持其高級結構［8］。CD38在脊椎動物造血組織、肌肉組織及內(nèi)分泌組織中廣泛的表達并具有多種酶的活性［9］。cADPR的生成需要NAD+與胞外的CD38活性中心反應，但NAD+主要存在于細胞內(nèi)和血漿中，細胞外的濃度僅在 10 ～40 nmol/L［10］。NAD+可由連接蛋白43(Cx43)介導轉(zhuǎn)運出胞。研究發(fā)現(xiàn)，當抑制小鼠3T3成纖維細胞膜上Cx43基因的表達后，細胞內(nèi)外NAD+的雙向轉(zhuǎn)運被完全抑制［11］，同時胞內(nèi)cADPR的含量也顯著降低［12］。將純化的Cx43基因構建于蛋白脂質(zhì)體膜上，NAD+的轉(zhuǎn)運活性得到了恢復［11］。Cx43是排列于各細胞間的六聚體通道蛋白，形成了細胞間的縫隙連接，可以通過它們進行細胞內(nèi)和細胞間的物質(zhì)交換［11］。NAD+的轉(zhuǎn)運受到多種因素的調(diào)控。螯合NIH-3T3細胞內(nèi)外Ca2+后，細胞內(nèi)外NAD+的流量顯著增高，而增加胞內(nèi)Ca2+濃度后，NAD+的轉(zhuǎn)運降至最低［11－12］。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度的升高可激活蛋白激酶C引起Cx43磷酸化，磷酸化后的Cx43失去轉(zhuǎn)運功能［12］。另外，小鼠成纖維細胞內(nèi)NAD+的轉(zhuǎn)運還與細胞膜上CD38的表達量呈反比關系［12］。cADPR作用的靶位點是細胞內(nèi)Ca2+儲存膜上的RyR［13］，因此細胞外合成的cADPR必須被運送至胞內(nèi)才能發(fā)揮其生物學功能。cADPR的轉(zhuǎn)運需要 CD38 的參與［11－12］，但 CD38 只能轉(zhuǎn)運自身催化合成的cADPR，外源添加的cADPR不能被CD38轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)［14］。CD38可能在催化過程中發(fā)生了構象改變，從而具有轉(zhuǎn)運活性。CD38還可能在翻譯后發(fā)生交聯(lián)，從而形成多聚體，使其可能具有轉(zhuǎn)運功能［15］。Franco 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白脂質(zhì)體膜上表達相對分子質(zhì)量為46、86～112、197的3種類型的CD38，CD38可能以多聚體的形式形成了cADPR通道，使cADPR迅速內(nèi)流。

生物體除了通過將底物轉(zhuǎn)運出胞再將產(chǎn)物轉(zhuǎn)運入胞這種相對復雜的方式合成cADPR外，它還可以通過配體介導CD38內(nèi)化，使催化反應直接在胞內(nèi)進行［9，16］。將人類 CD38基因轉(zhuǎn)染到 Hela細胞，配體NAD+介導CD38以囊泡的形式逐漸內(nèi)化［17］。白介素－8(IL-8)可誘導人類淋巴細胞因子激活的殺傷細胞表面的CD38內(nèi)化［16］。CD38的內(nèi)化與高度保守的半胱氨酸殘基密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸－119和半胱氨酸－201位突變后的CD38分子不能內(nèi)化，119位和201位半胱氨酸殘基通過形成分子間二硫鍵，使CD38以二聚體形式內(nèi)化［18］。內(nèi)化的CD38仍具有酶的活性，能催化產(chǎn)生cADPR、調(diào)節(jié)Ca2+濃度［16］。在多種類型的細胞內(nèi)，配體NAD+在引起細胞膜表面環(huán)化酶活性降低的同時，胞內(nèi)Ca2+的濃度也升高，但如果CD38 缺失，這種作用則完全消失［9，16］。

3 cADPR介導胞內(nèi)Ca2+釋放途徑

cADPR的主要功能是釋放胞內(nèi)儲存的Ca2+。在海膽卵細胞［1］、小鼠成纖維細胞［12］、小鼠生精小管外周平滑肌細胞［2］及人 T 淋巴細胞［3］，cADPR都可引起胞內(nèi)儲存Ca2+的釋放。cADPR釋放Ca2+的途徑是通過激活Ca2+儲存膜上對蘭尼堿敏感的 RyR［19－20］。但也有不一致的報道，cADPR 可以引起牛冠狀動脈平滑肌細胞肌漿網(wǎng)膜RyR通道的開放，而抑制RyR通道活性后，cADPR不能引起Ca2+的釋放［13］;在豬心肌RyR脂雙分子層上，cADPR不能介導胞內(nèi)Ca2+的釋放［21］。RyR是由相對分子質(zhì)量為560的多肽組成的同源四聚體對稱型離子通道，它是一種跨膜蛋白，90%的氨基酸序列位于胞漿內(nèi)，其上有多種調(diào)節(jié)蛋白的連接位點，他克莫司連接蛋白(FKBP)可與每個亞基上特異位點結合，并在一定程度上引起RyR的構象改變，從而調(diào)節(jié)其生物學功能［22］。FKBP在牛冠狀動脈平滑肌細胞［19］、氣管平滑肌細胞［20］、小鼠膀胱平滑肌細胞［23］內(nèi)廣泛地表達。特異表達的FKBP與肌漿網(wǎng) RyR 結合［19－20］。FKBP 可以穩(wěn)定RyR的關閉狀態(tài)，從而抑制RyR的活性。將FKBP透析入氣管平滑肌細胞，Ca2+通道的開放率顯著降低，若使 FKBP與 RyR分離，Ca2+的釋放增加［20］。FKBP還會減少由刺激引起的RyR通道的開放，由去極化誘導FKBP基因敲除的小鼠膀胱平滑肌細胞Ca2+的局部釋放高于野生型小鼠［23］。cADPR激活RyR通道是通過與FKBP特異位點結合使FKBP與RyR分離。研究發(fā)現(xiàn)，cADPR可以引起牛冠狀動脈平滑肌肌漿網(wǎng)膜Ca2+通道的開放，而 FKBP表達被抑制后，cADPR不能引起Ca2+的釋放;將 cADPR透析入平滑肌細胞后，Ca2+的釋放量顯著增加，并且此時形成了cADPRFKBP復合物，使 FKBP與 RyR分離，Ca2+通道開放［19－20］。

cADPR激活RyR還需要鈣調(diào)蛋白的參與。鈣調(diào)蛋白相對分子質(zhì)量為16.7，對Ca2+的親和力很高，它能與RyR各亞基特異位點結合并調(diào)節(jié)其功能［22，24］。無鈣調(diào)蛋白的海膽卵微粒體和鼠胰島微粒體失去了對cADPR的敏感性，加入純化的鈣調(diào)蛋白后，其敏感性得以恢復，Ca2+釋放增加［24］。鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)RyR通道活性的方式是通過與RyR復合物特異結合和分離這種循環(huán)過程來完成的［24］。影響鈣調(diào)蛋白與RyR連接的主要因素是胞漿內(nèi)游離Ca2+的濃度。當游離Ca2+的濃度改變時，兔心肌細胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白與RyR的親和力發(fā)生變化，引起RyR構象改變從而調(diào)節(jié)Ca2+通道的開放［25］。綜上所述，cADPR激活RyR還需要鈣調(diào)蛋白的參與，而胞漿內(nèi)游離Ca2+的濃度又是影響鈣調(diào)蛋白與RyR結合的主要因素，二者相互作用從而保證細胞內(nèi)Ca2+濃度的平衡。

4 cADPR的生理功能

研究發(fā)現(xiàn)，cADPR是多種細胞內(nèi)調(diào)節(jié)Ca2+濃度的第二信使。外源的刺激引起cADPR合成量增加，釋放胞內(nèi)儲存的Ca2+，Ca2+濃度的升高引起信號轉(zhuǎn)導，產(chǎn)生一系列生理反應［4］。在大鼠生精小管外周平滑肌細胞［2］、小鼠胰島細胞［17］、人 T淋巴細胞［3］、PC12 細胞［5］，滲透化處理的 cADPR都可使胞內(nèi)Ca2+濃度改變、引起肌細胞收縮、促進胰島素分泌、活化T淋巴細胞和促進神經(jīng)細胞增殖分化。外源的各種刺激主要是通過上調(diào)cADPR合成酶的分泌量，使cADPR合成增加。用內(nèi)皮縮血管肽－1(ET-1)刺激大鼠生精小管外周平滑肌細胞，細胞膜上CD38酶的活性顯著增強，平滑肌細胞收縮增強［2］。在不同組織中，cADPR的效應時間不同［5，17］，并且效應強度也有差別。在新西蘭白鼠脈平滑肌細胞和PC12細胞內(nèi)，cADPR拮抗劑只能部分抑制外援刺激引起的生理反應［4－5］。說明在不同細胞內(nèi)由cADPR介導的Ca2+釋放程度不同，可能還存在其它信號轉(zhuǎn)導途徑通過與cADPR途徑協(xié)調(diào)作用，使生物體對外源刺激的調(diào)控機制更加精密。

表1 cADPR在不同組織內(nèi)的第二信使功能Table 1 Roles of cADPR as a second messenger in various tissues

5 小結

cADPR是調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度的第二信使。通過傳遞細胞外的信號，釋放胞內(nèi)Ca2+儲存，產(chǎn)生一系列相應的生理反應。cADPR的合成機制非常嚴密，不僅底物與酶由區(qū)室化的細胞器隔開，而且生成的產(chǎn)物也必須由催化激活的轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運入胞內(nèi)發(fā)揮功能。生物體還可直接將CD38內(nèi)化，從而使整個過程在胞內(nèi)進行。生成的cADPR激活胞內(nèi)Ca2+儲存膜上的RyR，這個過程可能需要FKBP和鈣調(diào)蛋白的參與，使胞內(nèi)Ca2+調(diào)控機制更加精密。目前的研究主要集中于cADPR功能的研究，對外源刺激引起cADPR合成的分子機制還不清楚，有待進一步深入研究。目前對cADPR的靶位點RyR的分子結構研究較少，而認識RyR的分子結構也是我們深入了解cADPR在體內(nèi)發(fā)揮作用的前提。

［1］LEE H C，WALSETH T F，BRATT G T，et al.Structural determination of a cyclic metabolite of NAD+with intracellularCa2+-mobilizing activity［J］.Journal of Biological Chemistry，1989，264(3):1608－1615.

［2］BARONE F，GENAZZANI A A，COMTI A，et al.A pivotal role for cADPR-mediated Ca2+signaling:regulation of endothelin-induced contraction in peritubular smooth muscle cells［J］.The FASEB Journal，2002，16(7):697－705.

［3］BECK A，KOLISEK M，BAGLEY L A，et al.Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate and cyclic ADP-ribose regulate TRPM2 channels in T lymphocytes［J］.The FASEB Journal，2006，20(7):962 －964.

［4］WILSON H L，DIPP M，THOMAS J，et al.ADP-ribosyl cyclase and cyclic ADP-ribose hydrolase act as a redox sensor［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276(14):11180－11188.

［5］YUE J，WEI W ，LAM C M C，et al.CD38/cADPR/Ca pathway promotes cell proliferation and elays nerve growth factor-induced differentiation in PC12 cells［J］.Journal of Biological Chemistry，2009，284(43):29335－39442.

［6］LEE H C，AARHUS R，LEVITT D.The crystal structure of cyclic ADP-ribose［J］.Nature Structural＆Molecular Biology，1994，1(3):143－144.

［7］GUSE A H，CAKIR-KIEFER C，F(xiàn)UKUOKA M，et al.Novel hydrolysis-resistant analogues ofcyclic ADP-ribose:modification of the‘northern’ribose and calcium release activity［J］.Biochemistry，2002，41(2):6744－6751.

［8］LEE H C.Structure and enzymatic functions of human CD38［J］.Molecular Medicine，2006，12(11/12):317－323.

［9］FUNARO A，REINIS M，TRUBIANI O，et al.CD38 functions are regulated through an internalization step［J］.The Journal of Immunology，1998，160(5):2238－2247.

［10］DE FLORA A，GUIDA FRANCO L，ZOCCHI E，et al.Ectocellular in vitro and in vivo metabolism of cyclic ADP-ribose in cerebellum［J］.Biochemistry，1996，320:665－672.

［11］BRUZZONE S，GUIDA L，ZOCCHI E，et al.Connexin 43 hemichannels mediate Ca2+-regulated transmembrane NAD+fluxes in intact cells［J］.The FASEB Journal，2000，15(1):10 －12.

［12］BRUZZONE S，F(xiàn)RANCO L，GUIDA L，et al.A self-restricted CD38-connexin 43 cross-talk affects NAD+and cyclic ADP-ribose metabolism and regulates intracellular calcium in 3T3 fibroblasts［J］.Journal ofBiologicalChemistry，2001，276(51):48300－48308.

［13］LI P L，TANG W X，VALDIVIA H H，et al.cADP-ribose activates reconstituted ryanodine receptors from coronary arterial smooth muscle［J］.Heart and Circulatory Physiology，2001，280(1):208 －215.

［14］FRANCO L，GUIDA L，BRUZZONE S，et al.The transmembrane glycoprotein CD38 is a catalytically active transporter responsible for generation and influx of the second messenger cyclic ADP-ribose across membranes［J］.The FASEB Journal，1998，12(14):1507－1520.

［15］SHAHID U，MALAVASI F，MEHTA K.Post-translational modification of CD38 protein into a high molecular weight form alters its catalytic properties［J］.Journal of Biological Chemistry，1996，271(21):15922－15927.

［16］RAH S Y，PARK K H，NAM T S，et al.Association of CD38 with nonmuscle myosin heavy chainⅡA and Lck is essential for the internalization and activation of CD38［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282(14):5653－5660.

［17］ZOCCHI E，USAI C，GUIDA L，et al.Ligand-induced internalization of CD38 results in intracellular Ca2+mobilization:role of NAD+transport across cell membranes［J］.The FASEB Journal，1999，13(2):273－283.

［18］HAN M K，KIM S J，PARK Y R.Antidiabetic effect of a prodrug of cysteine，L-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid，through CD38 dimerization and internalization［J］. Journal ofBiological Chemistry，2002，277(7):5315－5321.

［19］TANG W X，CHEN Y F，ZOU A P.Role of FKBP12.6 in cADPR-induced activation of reconstituted ryanodine receptors from arterial smooth muscle［J］.Heart Circle Physiological，2002，282(4):H1304 －H1310.

［20］WANG Y X，ZHENG Y M，MEI Q B，et al.FKBP12.6 and cADPR regulation of Ca2+release in smooth muscle cells［J］.Cell Physiology，2004，286(3):C538－C546.

［21］FRUEN B R，MICKELSON J R，SHOMER N H，et al.Cyclic ADP-ribose does not affect cardiac or skeletal muscle ryanodine receptors［J］.FEBS Letters，1994，352(2):123－126.

［22］WAGENKNECHT T，RADERMACHER M，GRASSUCCI R，et al.Locations of calmodulin and FK506-binding protein on the three-dimensional architecture of the skeletal muscle ryanodine receptor［J］.Journal of Biological Chemistry，1997，272(51):32463 －32471.

［23］JI G，F(xiàn)ELDMAN M E，GREENE K S，et al.RYR2 proteins contribute to the formation of Ca2+sparks in smooth muscle［J］.General Physiology，2004，123(4):377－386.

［24］THOMAS J M，SUMMERHILL R J，F(xiàn)RUEN B R，et al.Calmodulin dissociation mediates desensitization of the cADPR-induced Ca2+release mechanism［J］.Current Biology，2002，12(23):2018－2022.

［25］BALSHAW D M，XU L，YAMAGUCHI N，et al.Calmodulin binding and inhibition of cardiac muscle calcium release channel(ryanodine receptor)［J］.Journal of Biological chemistry，2001，276(23):20144－20153.