柔毛淫羊藿對骨質(zhì)疏松小鼠的作用研究

韓小東，張金娟，任光友 ，張貴林

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床系，陜西延安716000；2.貴陽醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州貴陽550004

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種病因病理復(fù)雜，以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病。OP的發(fā)病率正逐年升高，引起全世界的廣泛關(guān)注。女性絕經(jīng)后，雌激素缺乏，骨吸收大于骨形成，引起OP，稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。近年來，眾多學(xué)者對雌激素及植物雌激素防治OP作用進行了大量研究，取得了重要進展[1]。IL-6是強有力的骨吸收刺激因子[2]。本實驗采用去卵巢復(fù)制骨質(zhì)疏松小鼠模型，重點觀察柔毛淫羊藿對骨密度、破骨細胞數(shù)和IL-6骨表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與藥材

昆明種小鼠，雌性，體重20～22 g，貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心。柔毛淫羊藿浸膏，1 g浸膏相當(dāng)于生藥材6.28 g。己烯雌酚（DES）：合肥久聯(lián)制藥有限公司。一抗兔抗鼠IL-6多克隆抗體（IL-6）和二抗山羊抗兔IgG均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 模型制備與實驗分組

用0.4%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉，相對無菌條件下摘除雙側(cè)卵巢。對照組同法僅摘除卵巢旁綠豆大脂肪組織。實驗動物共分：對照組（蒸餾水10 ml/kg）、模型組（蒸餾水 10ml/kg）、DES 組（2mg/kg）、EPM 高劑量組（200mg/kg）、EPM 中劑量組（100 mg/kg）、EPM 低劑量組（50 mg/kg），每組14只，無鈣飼料喂養(yǎng)。造模后45 d，各組動物按上述相應(yīng)劑量灌胃給藥，每日一次，連續(xù)60 d。

1.3 雙能X線吸收法確立OP動物模型

去勢后45 d取實驗組和對照組小鼠各10只用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，四肢伸展平放在LUNAR骨密度儀上通過計算機系統(tǒng)動物軟件測量全身和脊柱骨密度[3]。

1.4 取材及標(biāo)本制備

停藥次日處死動物后，立即無菌操作取右側(cè)股骨下端，迅速放入4%甲醛固定液中，4℃冰箱保存，后置入濃度為100 g/L的EDTA脫鈣15 d，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，光鏡觀察骨組織微觀結(jié)構(gòu)。用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行破骨細胞數(shù)及SABC法免疫組織化學(xué)結(jié)果進行分析，IL-6染色陽性結(jié)果判定以組織或細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為標(biāo)準(zhǔn)。每個標(biāo)本隨機選取9個視野，取其均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析。各組間兩兩比較采用LSD法，檢驗水平α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BMD數(shù)據(jù)分析

模型組脊柱及全身骨密度明顯低于對照組 (P＜0.05)，己烯雌酚明顯提高脊柱及全身骨密度，EPM各劑量組脊柱和全身骨密度均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），見表 1。

表1 各組小鼠BMD數(shù)據(jù)分析(x±s，n=14）

2.2 破骨細胞數(shù)的測定結(jié)果

模型組比對照組的破骨細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），EPM各組動物的破骨細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），見表2。

表2 EPM對OP小鼠骨組織破骨細胞數(shù)的影響(x±s，n=14）

2.3 各組動物IL-6的數(shù)據(jù)結(jié)果

模型組比對照組的IL-6表達明顯增加 （P＜0.01），EPM各劑量組動物的IL-6表達比模型組明顯降低 （P＜0.05），見表3。

表3 IL-6的數(shù)據(jù)分析

3 討論

絕經(jīng)后主要是由卵巢分泌的雌激素水平降低所致，具體機制尚不清楚。本實驗采用去卵巢復(fù)制OP模型與絕經(jīng)后或切除卵巢的OP患者病理過程極為相近[4]。骨代謝過程中，骨吸收和骨形成都受到多種因素的調(diào)控，以保持二者的平衡[5]。破骨細胞在骨吸收中起重要作用，其來源于骨髓造血干細胞[5-6]，是負責(zé)骨吸收的功能細胞。一些抑制骨吸收的因子如雌激素等，能夠誘導(dǎo)破骨細胞的凋亡[7-8]。破骨細胞在骨基質(zhì)上的水平提高，會使得骨吸收大于骨形成，從而導(dǎo)致OP。EPM使破骨細胞數(shù)降低，使骨重建過程中的骨形成大于骨吸收，有益于OP的治療。IL-6可使破骨細胞的活性增強，數(shù)量增加，進而導(dǎo)致骨吸收增加。雌激素水平下降會導(dǎo)致IL-6基因表達失控，IL-6表達升高[9]。Poli等[10]報道IL-6基因缺陷的小鼠不能產(chǎn)生IL-6，切除卵巢后骨密度和骨轉(zhuǎn)換率都不發(fā)生改變，更進一步證實IL-6致骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。本次實驗中，IL-6陽性顆粒主要表達在骨髓基質(zhì)細胞、巨噬細胞及成骨細胞細胞漿中，這與鄧廉夫及Inanir等[11-12]的報道一致。模型組IL-6的高表達可能提示絕經(jīng)后雌激素水平降低的情況下，骨組織表達IL-6的細胞數(shù)目有所增加而導(dǎo)致IL-6的水平也相應(yīng)升高。但也不排除雌激素可能有對控制IL-6基因編碼的直接作用。EPM使去卵巢小鼠骨密度增加、破骨細胞數(shù)減少，使骨組織中IL-6的表達降低。究其原因是EPM發(fā)揮了擬雌激素作用還是EPM含有競爭性IL-6受體的配體物質(zhì)有待進一步研究。

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