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    分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中上皮鈉通道m(xù)RNA的表達(dá)及其意義*

    2011-06-05 14:36:25李祥翠張奕李吉平王家東
    關(guān)鍵詞:中耳中耳炎造模

    李祥翠 張奕 李吉平 王家東

    ·研究報(bào)告·

    分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中上皮鈉通道
    mRNA的表達(dá)及其意義*

    李祥翠1張奕1李吉平1王家東1

    目的 探討上皮鈉通道(epithelial sodium channel,ENaC)m RNA在分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中的表達(dá)及其意義。方法 12只SD大鼠實(shí)驗(yàn)耳經(jīng)鼓膜注入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)動(dòng)物模型,在造模后第二天取中耳黏膜,采用實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction,Red time PCR)檢測(cè)中耳黏膜中ENaC-mRNA的表達(dá),并與對(duì)照耳(注入等量生理鹽水)相比較。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)耳α-、β-、γ-ENaC-m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.007 8、0.009 2、0.007 6,對(duì)照耳α-、β-、γ-ENaC-m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.012 1、0.012 6、0.011 7;實(shí)驗(yàn)耳相α-、β-、γ-ENaC-mRNA相對(duì)于對(duì)照組分別下調(diào)1.56倍(P<0.05)、1.37倍(P<0.05)、1.53倍(P<0.01)。結(jié)論 ENaC在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜中基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào),這可能是導(dǎo)致OME早期積液形成的機(jī)制之一。

    中耳炎,分泌性; 上皮鈉通道; 實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)

    維持中耳腔的相對(duì)干燥狀態(tài)從而保證聲波從鼓膜正常地傳導(dǎo)至內(nèi)耳是中耳黏膜的基本生理功能之一。中耳黏膜和呼吸道黏膜具有同源性,即中耳黏膜表面亦覆蓋著氣道表面液體(airway surface liquid,ASL),其電解質(zhì)、水分的成分及量的相對(duì)恒定在維持中耳黏膜的相對(duì)干燥狀態(tài)中起著重要作用[1]。研究表明,上皮鈉通道(epithelial sodium channel,ENaC)通過(guò)對(duì)離子和水的轉(zhuǎn)運(yùn),在維持肺泡腔的液體平衡中起著重要作用,并能夠?qū)Ψ闻葜蟹e液進(jìn)行快速清除[2]。有研究表明中耳黏膜上皮同樣具有ENaC介導(dǎo)的液體吸收功能[1]。為了觀察分泌性中耳炎狀態(tài)下中耳黏膜ENaC的變化,本研究采用實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction,Red time PCR)技術(shù)從基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的大鼠OME模型中耳黏膜中ENaC-mRNA表達(dá)情況,報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模[3]清潔級(jí)健康SD雄性大鼠12只(24耳),鼠齡5~7周,體重140~250克,無(wú)噪聲暴露和耳毒性藥物使用史,耳廓反射靈敏,解剖顯微鏡下外耳道、鼓膜均無(wú)異常,術(shù)前ABR、聲導(dǎo)抗檢測(cè)結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。大鼠苯巴比妥鈉(70 mg/kg)腹腔注射后,安爾碘消毒外耳道,采用微量注射器將200μg/ml的LPS 25μl經(jīng)鼓膜前下方注入試驗(yàn)耳,對(duì)照耳注入等量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)一編號(hào),統(tǒng)一進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 總RNA的提取 在動(dòng)物造模后第二天于苯巴比妥鈉(70 mg/kg)腹腔注射麻醉后,快速斷頭處死,取出聽(tīng)泡用去RNA酶處理的器械打開(kāi)聽(tīng)泡,在解剖顯微鏡下剝離中耳腔鼓岬、中下鼓室及咽鼓管周?chē)酿つ?,立即放入去RNA酶處理的離心管中,液氮保存,由于大鼠中耳黏膜量極少,故將每?jī)芍粍?dòng)物的中耳黏膜標(biāo)本合并為一份實(shí)驗(yàn)樣品,共6份樣品。應(yīng)用Trizol法抽提總RNA,用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

    1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA 取5μg總RNA+1μl寡居脫氧核苷酸[Oligo(d T)20]+1μl d NTP(10 mol/ml),用焦碳酸二乙酯水補(bǔ)足至總體積10μl;65℃變性5 min,立即置于冰上至少1 min;加入10μl合成互補(bǔ)DNA反應(yīng)混合液,該混合液(2μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4μl MgCl2(25 mol/L)、2 μl DTT(0.1 mol/L)、1μl RNaseOUTTM(40 U/μl)、1μl Superscript TMⅢRT(200 U/μl)),50℃50 min互補(bǔ)DNA合成;85℃50 min終止反應(yīng);加入1μl E.coliRNA酶H(2 U/μl),37℃20 min酶解殘留的RNA;-20℃保存。

    1.2.3 Real time PCR反應(yīng) ①引物設(shè)計(jì)如下:α-ENaC(174 bp),正向引物:5′CAGTTCGCCTTGCTGTTCG3′,反向引物:5′AAGCGTCTGCTCCGTGAGT3′;β-ENaC(724 bp),正向引物:5′CAACACGACCTATTCCATCC3′,反向引物:5′AGCCTCAGGGAGTCATATG3′;γ-ENaC(286 bp),正向引物:5′ACAAAGACCTGAACCAAAG3′,反向引物5′GCATAGCAGAGGTAAAAGT3′;β-actin(211 bp,內(nèi)參照),正向引物:5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′,反向引物:5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′。②PCR反應(yīng)體系:取100 ng模板互補(bǔ)DNA+10μl 2×QuantiFast SYBRGREEN PCR Master Mix+1μl正向引物(10μmol)+1μl反向引物(10μmol),用不含RNA酶的水補(bǔ)足至總體積20 μl;每個(gè)樣本互補(bǔ)DNA的每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)孔。③95℃變性3 min;40個(gè)PCR循環(huán)(94℃,20秒;59℃,20秒;72℃,30秒);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1,分別稀釋為1×10-1、1×10-2、1 ×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1× 10-9這幾個(gè)濃度的DNA;將這幾個(gè)梯度稀釋的DNA模板以及所有的cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系,置于Realtime PCR反應(yīng)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)?;?qū)崟r(shí)定量PCR反應(yīng)條件:95℃,5 min;40個(gè)PCR循環(huán)[(95℃,10秒;59℃,15秒;72℃,20秒;82.5℃(收集熒光),5秒]。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢升溫至99℃(每5秒升高1℃),建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,以鑒定產(chǎn)物是否單一。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)7 300 System Software軟件的分析,計(jì)算出樣本中各基因的循環(huán)閾值(CT值)。CT值經(jīng)對(duì)數(shù)擬合作圖,得到定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)E=10(-1/slope)計(jì)算擴(kuò)增效率,采用管家基因β-actin(不同樣品間的表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參來(lái)校正,待測(cè)樣品基因相對(duì)含量=2-△CT(△CT=待測(cè)基因CT-管家基因CT)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示,組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    造模后4~6小時(shí)解剖顯微鏡觀察所有大鼠的實(shí)驗(yàn)耳鼓膜渾濁,造模后第二天12只大鼠實(shí)驗(yàn)耳均現(xiàn)中耳積液,對(duì)照耳鼓膜透明,即12只試驗(yàn)耳均造模成功。大鼠實(shí)驗(yàn)耳中耳腔黏膜α-、β-、γ-ENaC-m RNA的轉(zhuǎn)錄相對(duì)于對(duì)照耳分別下調(diào)1.56倍、1.37倍和1.53倍(表1)。

    表1 大鼠中耳黏膜上皮鈉通道m(xù)RNA相對(duì)表達(dá)量(ˉx±s)

    3 討論

    上皮鈉通道(epithelial sodium channel,ENaC)介導(dǎo)的液體吸收在各種組織的鈉、水平衡中起著重要的作用,已有研究表明ENaC分布在各級(jí)呼吸道(從鼻咽到細(xì)支氣管)上皮細(xì)胞的腔頂面[4],對(duì)維持氣道黏膜ASL的穩(wěn)定性起著重要作用[5]。Choi等[6]采用改良的Ussing室宏觀電生理測(cè)量方法研究發(fā)現(xiàn)中耳黏膜上皮細(xì)胞ENaC介導(dǎo)的amiloride敏感的的短路循環(huán)電流(amiloride-sensitive Isc)顯著高于鼻黏膜上皮細(xì)胞,由于ENaC介導(dǎo)的Isc反應(yīng)細(xì)胞對(duì)Na+的吸收能力,故ENaC在中耳黏膜上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)較鼻黏膜上皮細(xì)胞大,這可能與人中耳黏膜上皮細(xì)胞要保持中耳腔的相對(duì)干燥狀態(tài)有關(guān);通過(guò)Western blot檢測(cè)對(duì)比兩種組織中的ENaC三個(gè)亞基的表達(dá)發(fā)現(xiàn),中耳黏膜組中的ENaC蛋白表達(dá)顯著高于鼻黏膜組;該研究進(jìn)一步通過(guò)比較兩者的amiloride敏感液體吸收率發(fā)現(xiàn),中耳黏膜的液體吸收率顯著快于鼻黏膜,進(jìn)一步從功能上證實(shí)ENaC在中耳黏膜上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用的重要性,在維持中耳腔黏膜的較薄的ASL的穩(wěn)定性中起著重要作用。另有研究[7~9]也表明體外培養(yǎng)的中耳黏膜上皮細(xì)胞也有ENaC表達(dá)且在積液吸收中起著主導(dǎo)作用。近年來(lái),本課題組[10,11]報(bào)道了健康大鼠的中耳黏膜具有ENaC介導(dǎo)的鈉、水轉(zhuǎn)運(yùn)功能,進(jìn)一步在活體中證實(shí)了ENaC介導(dǎo)的液體吸收在中耳生理學(xué)中的作用。

    以上研究均是在正常情況下研究ENaC在中耳黏膜上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用,那么在病理狀態(tài)下(如OME)下,ENaC是否也發(fā)揮著同樣的作用呢?本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)比研究OME模型豚鼠實(shí)驗(yàn)耳與對(duì)照耳ENaC-m RNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)與對(duì)照耳相比,實(shí)驗(yàn)耳α-、β-、γ-ENaC-mRNA的轉(zhuǎn)錄均顯著下調(diào),即在炎癥早期,ENaC在中耳黏膜的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),這與Choi等[7]的研究結(jié)果相對(duì)一致。因?yàn)镮L-1β是重要的早期炎癥反應(yīng)因子之一且在OME中表達(dá)上升[12],通過(guò)對(duì)比IL-1β處理組(10 ng/ml培養(yǎng)液中處理24小時(shí))與正常組的人中耳黏膜上皮細(xì)胞的ENaC的mRNA轉(zhuǎn)錄及amiloride敏感的的Isc發(fā)現(xiàn):IL-1β處理后ENaC介導(dǎo)的Isc從14.2±1.3μA/cm2降至10.3± 1.4μA/cm2(P<0.05),α、β-ENaC-m RNA相對(duì)減少16%、41%,而γ-ENaC-mRNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯變化,由此推斷人中耳黏膜上皮細(xì)胞的ENaC在早期炎癥因子(IL-1β)的作用下在基因轉(zhuǎn)錄及功能等方面呈抑制狀態(tài),使中耳黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子功能下降,從而導(dǎo)致中耳積液,這可能是OME早期積液形成的機(jī)制之一。

    本研究發(fā)現(xiàn)在OME造模成功后第二天(即炎癥早期)中耳黏膜組織ENaC的轉(zhuǎn)錄呈下調(diào)狀態(tài),那么ENaC在OME的中晚期表達(dá)是否亦呈抑制狀態(tài)呢?Song等[13]通過(guò)堵塞健康大鼠咽鼓管誘導(dǎo)OME后研究ENaC在病理狀態(tài)下的表達(dá),在咽鼓管堵塞后的第2、4、8周(即炎癥中、晚期)取大鼠實(shí)驗(yàn)耳和對(duì)照耳聽(tīng)泡分別用PCR測(cè)定ENaC-m RNA的轉(zhuǎn)錄,發(fā)現(xiàn)α-ENaC-mRNA在第2、4周的轉(zhuǎn)錄顯著降低,但在第8周卻顯著增加至對(duì)照組的1.48倍;β-ENaC-mRNA在第2周時(shí)兩組無(wú)明顯差異,而在第4、8周時(shí)則顯著增加;而γ-ENaC-mRNA在第2、4、8周均呈顯著增加,故推測(cè)ENaC的表達(dá)可能與中耳黏膜組織暴露于炎癥狀態(tài)的時(shí)程有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。由于存在m RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制,炎癥早期ENaC的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)是否影響ENaC的蛋白表達(dá)及其功能有待進(jìn)一步的研究??傊?,本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼓膜注入LPS誘導(dǎo)的分泌性中耳炎大鼠模型中,在OME早期ENaC基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),這可能是OME早期積液形成的機(jī)制之一,其分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

    1 Portier F,Kania R,Planès C,et al.Enhanced sodium absorption in middle ear epithelial cells cultured at air-liquid interface[J].Acta.Otolaryngol,2005,125:16.

    2 Guidot DM,F(xiàn)olkesson HG,Jain L,et al.Integrating acute lung injury and regulation of alveolar fluid clearance[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,291:L301.

    3 Cho JG,Lee ES,Woo JS,et al.Expressions of cyclooxygenase 1 and 2 in endotoxin-induced otitis media with effusion in the rat[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2007,71:101.

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    6 Choi JY,Son EJ,Kim JL,et al.ENaC-and CFTR-dependent ion and fluid transport in human middle ear epithelial cells[J].Hear Res,2006,211:26.

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    11 李吉平,金曉杰,王家東,等.鈉離子濃度變化對(duì)大鼠中耳液體吸收功能影響的研究[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志,2008,16:411.

    12 Yellon RF,Leonard G,Marucha PT,et al.Characterization of cytokines present in middle ear effusions[J].Laryngoscope,1991,101:165.

    13 Song JJ,Kown SK,Kim EJ,et al.Mucosal expression of ENaC and AQP in experimental otitis media induced by Eustachian tube obstruction[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2009,73:1 589.

    (2011-02-11收稿)

    (本文編輯 李翠娥)

    10.3969/j.issn.1006-7299.2011.05.020

    時(shí)間:2011-9-5 14:59

    R764.21

    A

    1006-7299(2011)05-0457-03

    * 上海市衛(wèi)生局科研課題計(jì)劃(2007Y02)、上海交通大學(xué)“醫(yī)工(理)交叉研究基金”項(xiàng)目(YG2010MS28)聯(lián)合資助

    1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科、上海交通大學(xué)(醫(yī)學(xué)院)耳鼻咽喉科研究所(上海 200127)

    李吉平(Email:lijp74@yahoo.com.cn)

    網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20110905.1459.013.html

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