應(yīng)用改進ELISA檢測干血棉球HIV抗體的可行性研究

趙紅玉 李 穎

1.甘肅省靈臺縣疾病預(yù)防控制中心，甘肅靈臺 744400；2.甘肅省平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院，甘肅平?jīng)?744000

目前我國HIV抗體篩查實驗室都采用ELISA法檢測血清樣品中HIV抗體，而血清在常溫下存放容易變質(zhì)；雖然用濾紙干血斑樣品便于儲存和運輸，但因樣品載量?。總€濾紙片載體僅容納50～100 μL血清），其應(yīng)用范圍受到限制。選擇何種載體既具有較大的樣品載量，以便進行多項目檢測，又便于在常溫下容易儲存和運輸；又用何種方法檢測這種特殊載體的HIV抗體，這是本研究要探討的兩個問題。醫(yī)用脫脂棉柔軟膨松，吸水性極強，有容易獲得，是血清樣品的最佳載體。將血清滴于干棉球上制成干血棉球，具有較大的血清容量（每克棉球可吸納約200～400 μL血清），儲存和運輸都比較方便，而且樣品的前處理也非常容易。為研討干血棉球代替血清樣品檢測HIV抗體的可行性，筆者用ELISA法對298份干血棉球與相同血清樣品進行了實驗對比。為彌補干血棉球處于較高溫度、儲存較長時間可能會引起HIV抗體陽性樣品OD值降低，導(dǎo)致弱陽性出現(xiàn)假陰性結(jié)果，本實驗又對檢測干血棉球HIV抗體的ELISA法進行改進，以提高檢測方法的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

HIV抗體陽性樣品來自筆者所在縣隨訪管理的艾滋病患者和HIV感染者及用HIV抗體陰性血清稀釋HIV抗體陽性血清制成的弱陽性樣品，共100份，其中S/CO比值在1～3的弱陽性樣品20份；HIV抗體陰性樣品為自愿咨詢檢測及公共場所從業(yè)人員，共198份。

1.1.1 血清樣品制備 采集靜脈血5 mL，室溫放置2 h，自然凝固后3 000 r/min離心15 min分離血清，置-20 ℃保存使用。

1.1.2 干血棉球 器材:干棉球[2]，在具有圓形凹槽塑料膜一面，固定一個或幾個適當(dāng)大小的醫(yī)用脫脂棉球作為血清樣品的載體，在紙殼板的另一面可注明樣品來源、檢測目的、采血日期等項目。

制備：將血清樣品200 μL滴于1個棉球載體上，每份血清可滴于一至數(shù)個棉球載體，37℃干燥過夜，干燥器干燥后后置密封袋中，即為干血棉球。37℃儲存3周。

1.2 試劑

珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)，ELISA法檢測HIV-1/HIV-2抗體試劑，批號為2010100708。

1.3 儀器

美國產(chǎn)Stat Fax 2 100型全自動酶標(biāo)分析儀，美國產(chǎn)Stat Fax 2 600型洗板機。

1.4 方法

1.4.1 按試劑盒說明書操作 采用450/630 nm雙波長，不設(shè)空白對照。用美國產(chǎn)Stat Fax 2 100型全自動酶標(biāo)分析儀比色，結(jié)果以說明書給定參考值設(shè)置的酶標(biāo)儀判斷結(jié)果為準(zhǔn)。

1.4.2 干血棉球樣品處理液 取含有200μL血清樣品的干血棉球置于試管中，加生理鹽水200μL，混勻，溶解20～30 min，3 000 r/min離心15 min,取上清液（樣品處理液）備用。

1.4.3 改進ELISA 在ELISA法中，第1步加入陰性、陽性對照，待檢樣品由50μL改為100μL，溫育時間由30 min改為60 min；其他步驟和試劑用量同試劑說明書。

1.4.4 20份37℃儲存3周S/CO 比值在1～3的弱陽性血清，按ELISA說明書和改進ELISA兩種方法檢測。

2 結(jié)果

298份血清樣品用ELISA試劑盒說明書方法檢測，HIV抗體陽性100份；經(jīng)37℃儲存3周的298份相同血清干血棉球樣品處理液，用改進ELISA方法檢測，HIV抗體陽性99份。兩種樣品HIV抗體檢測結(jié)果符合率為99.0 %，經(jīng)x2檢驗，相同的血清干血棉球與血清樣品檢測結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩種方法檢測相同血清樣品HIV抗體結(jié)果比較

20份S/CO值在1～3的HIV抗體弱陽性樣品，其37℃儲存3周的干血棉球樣品處理液用ELISA法檢測，HIV抗體陽性11份，而用改進ELISA檢測，HIV抗體陽性20份。經(jīng)x2檢驗，兩種檢驗方法結(jié)果有所不同（P＜0.05）；說明用ELISA法檢測37℃儲存3周的干血棉球樣品處理液，有部分弱陽性樣品出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而用ELISA改進方法檢測結(jié)果均為陽性。見表2。

表2 干血棉球用說明書和用改進方法檢測HIV抗體弱陽性結(jié)果比較

3 討論

干血棉球樣品處理液在37℃儲存3周，用改進ELISA檢測HIV抗體，與相同血清樣品按ELISA法說明書操作，檢測結(jié)果比較，兩種樣品HIV抗體檢測結(jié)果符合率為 99%，經(jīng)x2檢驗，兩種檢驗方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；干血棉球集合了血清樣品和濾紙片樣品二者的優(yōu)點，既有容量大、易于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點，也可用干血棉球代替血清樣品用于HIV抗體的檢測。

37℃儲存3周的干血棉球，會引起HIV抗體活性降低，用生理鹽水溶解，又會引起HIV抗體濃度降低，HIV抗體弱陽性樣品，按ELISA檢測，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果；但通過對ELISA方法稍作改進，即增加待檢樣品量（50～100 μL），同時延長抗原-抗體反應(yīng)（溫育）時間（30～60 min），可避免這一現(xiàn)象發(fā)生。用改進ELISA檢測干血棉球與相同血清樣品按試劑說明書檢測結(jié)果比較，經(jīng)x2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；改進ELISA在實驗原理、操作步驟與試劑盒說明書完全相同，可用改進ELISA檢測干血棉球HIV抗體。

[1] 張俊平,馬改娣,張孟尚,等.抗人球蛋白法與酶法檢測ABO血型免疫抗體效價的比較[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47（30）：59.

[2] 孔繁生.一種保存干燥血清標(biāo)本的器具：中國，200520028244 [P].2006-04-05.