針?biāo)幉⒂脤?duì)帕金森病模型小鼠紋狀體DA、NE和5-羥色胺影響

陸征宇,趙虹,陳潔,程波,宗蕾

?

針?biāo)幉⒂脤?duì)帕金森病模型小鼠紋狀體DA、NE和5-羥色胺影響

陸征宇,趙虹,陳潔,程波,宗蕾

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)

觀察平顫解郁方配合針刺治療對(duì)帕金森病模型小鼠紋狀體DA、NE和5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的影響。將成年C57/BL雄性小鼠28只隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組和針?biāo)幗M4組,每組7只。采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法,測(cè)定各組小鼠紋狀體DA、NE和5-羥色胺(5-HT)的含量。模型組、西藥組和針?biāo)幗M小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量均顯著低于正常組(＜0.01,＜0.05),西藥組和針?biāo)幗M小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量顯著高于模型組(＜0.01,＜0.05)。平顫解郁方配合針刺治療可提高紋狀體下降的DA、NE、5-HT水平。

針刺;電針;帕金森病;大鼠;平顫解郁方;針?biāo)幉⒂?/p>

帕金森病(parkinson disease,PD)是一種中老年常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病,選擇性神經(jīng)遞質(zhì)的降低可能是產(chǎn)生PD的危險(xiǎn)因素之一。目前研究認(rèn)為,黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)以多巴胺為代表的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少是PD的一個(gè)重要病理生理特征。我們通過(guò)既往的臨床研究,發(fā)現(xiàn)平顫解郁方結(jié)合針灸治療具有較好的治療效果,能有效改善PD癥狀。本研究以C57/BL雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,探討平顫解郁方配合針刺治療對(duì)PD小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryp- tamine,5-HT)等神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響,從而為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

雄性8周齡C57/BL小鼠28只,體重20～25 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組和針?biāo)幗M4組,每組7只。

1.2 藥物制備

將熟地、生地、白芍、鉤藤、柴胡、制首烏、川芎等,根據(jù)文獻(xiàn)[1]方法制成2.0 g/mL水煎液,4℃保存?zhèn)溆谩⒆笮喟?芐絲肼配制成相當(dāng)于臨床等效劑量10倍的水溶液,得2.5 mg/mL溶液,隨配隨用。

1.3 主要試劑及儀器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)、多巴胺鹽酸鹽、去甲腎上腺素鹽酸鹽、5-羥色胺鹽酸鹽(美國(guó)Sigma公司)。LC210A型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)、Waters460電化學(xué)檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)、Hypersil ODS23柱(日本GL公司)、保護(hù)柱(DIKMA公司)、MicroMax RF高速離心機(jī)(國(guó)際儀器公司IEC)、LXJ2 ⅡB低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。華佗牌無(wú)菌針灸針0.40 mm×25 mm毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),G6805-2型電針儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)。

1.4 動(dòng)物模型制備

參照國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的MPTP腹腔注射的方法[2]復(fù)制PD小鼠模型。隨機(jī)分組的小鼠適應(yīng)環(huán)境10 d后開(kāi)始給藥,其中模型組、西藥組、針?biāo)幗M用生理鹽水溶解MPTP后,按30 mg/kg腹腔注射MPTP,每日1次,連續(xù)注射7 d,制備PD小鼠模型;正常組腹腔注射相應(yīng)量生理鹽水,每日1次,連續(xù)注射7 d。

1.5 動(dòng)物處理

模型復(fù)制后,各組動(dòng)物分別給予相應(yīng)的治療,每日1次,治療14 d。正常組給予生理鹽水灌胃(0.1 mL/ 10 g);模型組給予生理鹽水灌胃(0.1 mL/10 g);西藥組給予左旋多巴/芐絲肼灌胃(0.1 mL/10 g);針?biāo)幗M給予針刺百會(huì)、風(fēng)府、陽(yáng)陵泉三穴,毫針針刺后接G6805-2型電針儀,連續(xù)波,頻率為2 Hz,電流強(qiáng)度1 mA,刺激15 min及平顫解郁方灌胃(0.1 mL/10 g)。小鼠在最后一次相應(yīng)處理后,禁食、禁水,次日斷頭處死, 1 min內(nèi)開(kāi)顱取出全腦,在冰盤上解剖,準(zhǔn)確分離取出紋狀體組織,立即轉(zhuǎn)入－70℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法。取紋狀體組織勻漿,加正丁醇210 mL,混勻,于4℃下離心(10000 ×)15 min。取上清液,加0.11 mol/L HClO40.150 mL、正庚烷210 mL,旋渦振蕩3 min后低速離心(3000 ×)3 min。除去有機(jī)相,在下層的水相中加CHCl3210 mL,經(jīng)旋渦振蕩3 min、低速離心3 min后,取上層水樣直接進(jìn)樣,進(jìn)樣量20.0mL。流動(dòng)相為緩沖液(0.102 mol/L檸檬酸三鈉和0.105 mol/L磷酸氫二鈉):甲醇=90:10的溶液,經(jīng)0.145mm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣后使用,流速為110 mL/min。工作電極為玻璃碳電極,參比電極Ag/AgCl,電化學(xué)監(jiān)測(cè)器設(shè)定電壓為＋650 mV。共測(cè)定3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì),其洗脫順序依次為NE、DA、5-HT。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四組模型復(fù)制后行為

正常組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反應(yīng)靈敏,攝食正常,無(wú)明顯異常表現(xiàn)。模型組、西藥組和針?biāo)幗M小鼠在應(yīng)用MPTP腹腔注射后都出現(xiàn)了不同程度動(dòng)作減少、重復(fù)點(diǎn)頭、間歇性閉眼、向一側(cè)旋轉(zhuǎn),噪聲或痛刺激后僅有睜眼凝視或驚恐反應(yīng)、豎毛、頻繁竄蹦等急性海洛因樣反應(yīng),這些反應(yīng)在第2次腹腔注射MPTP后2～5 min內(nèi)產(chǎn)生,每次發(fā)作持續(xù)約5～30 min。注射MPTP第2天起小鼠逐漸出現(xiàn)暫時(shí)性(2～3 h)肢體行動(dòng)遲緩、軀干震顫、動(dòng)作減少、豎毛、尾巴過(guò)伸及爬桿試驗(yàn)障礙,注射MPTP第6～7天上述表現(xiàn)最為顯著。模型組、西藥組和針?biāo)幗M小鼠經(jīng)治療行為逐漸恢復(fù),但是部分西藥組小鼠在治療第13天起又出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙,表現(xiàn)為反復(fù)咀嚼、強(qiáng)制性啃咬。

2.2 四組紋狀體內(nèi)DA、NE、5-HT含量變化

由表1可見(jiàn),模型組、西藥組、針?biāo)幗MDA含量均低于正常組(＜0.01,＜0.05),西藥組、針?biāo)幗MDA含量高于模型組(＜0.01),西藥組與針?biāo)幗MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組、西藥組、針?biāo)幗MNE含量均低于正常組(＜0.01),西藥組、針?biāo)幗MNE含量高于模型組(＜0.01),西藥組與針?biāo)幗MNE含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組、西藥組、針?biāo)幗M5-HT含量均低于正常組(＜0.01,＜0.05),西藥組、針?biāo)幗M5-HT含量高于模型組(＜0.05),西藥組與針?biāo)幗M5-HT含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。

表1 四組小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量水平(±s,ng/g)

注:與正常組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與模型組比較3)＜0.01,4)＜0.05

3 討論

帕金森病臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作遲緩和姿勢(shì)平衡障礙等癥狀。DA、NE和5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的異常在帕金森病的發(fā)病中起著一定的作用[3-7]。PD最顯著的生物化學(xué)特征是腦內(nèi)DA含量減少。一般認(rèn)為,當(dāng)基底節(jié)中DA含量減少到70%以上時(shí)才出現(xiàn)臨床癥狀,運(yùn)動(dòng)遲緩和強(qiáng)直與黑質(zhì)-紋狀體DA含量減少有直接關(guān)系[8]。NE、5-HT在紋狀體中的含量也相當(dāng)高,在PD時(shí),紋狀體區(qū)的NE含量輕度至中度降低,5-HT含量亦有所下降。

用MPTP所建立的PD小鼠模型是目前較為理想的PD模型[9]。MPTP本身并無(wú)毒性,其進(jìn)入體內(nèi)在膠質(zhì)細(xì)胞單胺氧化酶B作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆?苯基-雙氫吡啶,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲基-苯基吡啶離子(MPP＋),MPP＋被DA轉(zhuǎn)運(yùn)體主動(dòng)攝取到DA神經(jīng)元胞體內(nèi),再進(jìn)入線粒體,抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性,使ATP合成減少,自由基生成增加,同時(shí)MPP＋還可以使細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積、Ca2＋平衡紊亂、一氧化氮合成增加、谷胱甘肽合成減少,這些因素均可加劇自由基的過(guò)度生成,降低細(xì)胞對(duì)自由基損傷的抵抗能力,最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性、死亡[10,11]。另外,MPTP對(duì)NE能和5-HT能神經(jīng)元也有一定的毒性作用,其機(jī)理尚不明確。

腹腔注射MPTP后小鼠產(chǎn)生急性海洛因樣反應(yīng)可能是與MPTP對(duì)NE、5-HT的系統(tǒng)功能和阿片受體活性的影響有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在連續(xù)給予左旋多巴治療一段時(shí)間后,小鼠會(huì)產(chǎn)生明顯的運(yùn)動(dòng)障礙。以往的研究認(rèn)為這與長(zhǎng)期應(yīng)用多巴藥物后紋狀體D2受體過(guò)度激活有關(guān)。近期有研究認(rèn)為這可能與紋狀體突觸后膜DA受體的波動(dòng)性刺激有關(guān),這種非生理性刺激破壞了基底節(jié)的功能網(wǎng)絡(luò)。由于紋狀體DA神經(jīng)末梢受損,對(duì)紋狀體DA濃度的緩沖能力下降,短效左旋多巴血漿濃度的波動(dòng)可能被直接傳輸?shù)郊y狀體,紋狀體DA受體受到紋狀體DA“脈沖”樣刺激,細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白表達(dá)失調(diào)、基底節(jié)輸出神經(jīng)元放電模式改變,最終產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙。

帕金森病屬于中醫(yī)學(xué)“顫證”、“腦病”等范疇,根據(jù)PD的臨床表現(xiàn),中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其基本病機(jī)是肝腎陰虛,患者常在肝腎不足的基礎(chǔ)上并發(fā)肝氣郁結(jié),是病機(jī)的演變或夾雜;PD多為本虛標(biāo)實(shí)之證,肝腎不足是為病之本,肝氣郁結(jié)乃為病之標(biāo),治療當(dāng)標(biāo)本同治,扶正與祛邪兼施,治療原則是補(bǔ)益肝腎,疏肝解郁。本實(shí)驗(yàn)所用平顫解郁方系在長(zhǎng)期臨床中反復(fù)調(diào)整篩選,該方熟地、生地補(bǔ)益肝腎為君藥,白芍、鉤藤柔肝熄風(fēng),柴胡疏肝解郁為臣藥,制首烏補(bǔ)益肝腎、川芎行氣解郁為佐藥,全方共奏補(bǔ)益肝腎、疏肝解郁之效。我們的臨床研究發(fā)現(xiàn)平顫解郁方對(duì)各期PD患者均有一定療效,能改善PD患者的運(yùn)動(dòng)癥狀和抑郁、便秘、乏力等非運(yùn)動(dòng)癥狀,可減少左旋多巴的用量,減少其副反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中針刺選用百會(huì)、風(fēng)府、陽(yáng)陵泉組方。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PD的病位在腦?！端貑?wèn)·骨空論》:“督脈者……上額交巔上……入絡(luò)腦”,“病變?cè)谀X,首取督脈”;百會(huì)為手足三陽(yáng)經(jīng)與督脈之會(huì)穴,位居于巔頂之上,開(kāi)竅通絡(luò)止顫,又補(bǔ)下元虛損,健腦寧神,疏瀉肝風(fēng)。風(fēng)府穴為督脈經(jīng)的腧穴,為治風(fēng)之要穴?！缎嗅樦敢x》:“或針風(fēng),先向風(fēng)府,百會(huì)中。”風(fēng)府穴又為督脈經(jīng)、陽(yáng)維脈的交會(huì)穴,督脈走行到風(fēng)府處,便入顱內(nèi),與腦府連系?！峨y經(jīng)·二十八難》:“督脈者……上至風(fēng)府,入屬于腦?！眱裳ㄏ嗯涔沧嗤ㄕ{(diào)腦絡(luò),祛風(fēng)止顫之功。現(xiàn)代研究認(rèn)為,帕金森患者的全腦血流量都有下降,針刺可以增加腦血流量,從而改善腦部的血液循環(huán),頭穴對(duì)腦血流的作用迅速而持久,這可否防止或延緩多巴胺能神經(jīng)元變性,尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。陽(yáng)陵泉是筋之會(huì)穴,為筋氣聚會(huì)之處?！峨y經(jīng)·四十五難》:“筋會(huì)陽(yáng)陵泉?！敝髦谓畈?舒筋活絡(luò),能解全身之顫動(dòng)。而且研究發(fā)現(xiàn)[12],針刺曲池、陽(yáng)陵泉兩穴位可使病人腦血管擴(kuò)張,血流速度加快,明顯改善腦供血的情況,加速病灶側(cè)大腦組織細(xì)胞的恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)治療,針?biāo)幗M和西藥組小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量顯著高于模型組。

綜上所述,平顫解郁方配合針刺治療能夠使PD小鼠紋狀體下降的DA、NE、5-HT水平升高,改善PD癥狀,且未見(jiàn)明顯不良反應(yīng),其詳細(xì)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 李儀奎.中藥藥理試驗(yàn)方法學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1991:38.

[2] 陳生弟.帕金森病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:116-127.

[3] Slaughter JR, Slaughter KA. Prevalence clinical manifestations, etiol- ogy, and treatment of depression in Parkinson's disease[J]. J Neuropsychiatry Clin Neurosci, 2001,13(2):187-196.

[4] Philippe R, Miroslava D, Andrew L,. Depression in Parkinson's disease: loss of dopamine and noradrenaline innervation in the limbic system[J]. Brain, 2005,128(6):1314-1322.

[5] Schuurman AG, van den Akker M, Ensinck KTJL,. Increased risk of Parkinson's disease after depression: A retrospective cohort study[J]. Neurology, 2002,58(10):1501-1504.

[6] Cote L. Depression: impact and management by the patient and family[J]. Neurology, 1999,52(7 Suppl 3):S7-9.

[7] Mayberg HS, Starkstein SE, Sadzot B,. Selective hypometabo- lism in the inferior frontal lobe in depressed patients with Parkinson's disease[J]. Ann Neurol, 1990,28(1):57-64.

[8] Dunnett SB, Bjorklund A. Prospects for new restorative and neuropro- tective treatments in Parkinson's disease[J]. Nature, 1999,399(6738 Suppl):A32-39.

[9] Beal MF. Experimental models of Parkinson's disease[J]. Nat Rev Neurosci, 2001,2(5):325-334.

[10] Nicklas WJ, Vyas I, Heikkila RE. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahy- dropyridine[J]. Life Sci, 1985,36(26):2503-2508.

[11] Nicklas WJ, Youngster SK, Kindt MV,. MPTP, MPP＋ and mitochondrial function[J]. Life Sci, 1987,40(8):721-729.

[12] 劉靖,連平.針灸配合康復(fù)訓(xùn)練治療中風(fēng)偏癱60例臨床觀察[J].中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志,2006,2(7):634-636.

Effect of Combined Acupuncture and Medicine on Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine in a Mouse Model of Parkinson Disease

-,,,,.

,2000437,

To investigate the effect of tremor and depression-relieving prescription plus acupuncture on striatal neurotransmitters DA, NE and 5-HT in a mouse model of Parkinson disease.Twenty-eight adult male C57/BL mice were randomly allocated to four groups: normal, model, Western drug and combined acupuncture and medicine, 7 mice each. Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents were measured by high efficiency liquid chromatography-electrochemical determination in every group of mice.Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents were significantly lower in the model, Western drug and combined acupuncture and medicine groups of mice than in the normal group (＜0.01,＜0.05) and significantly higher in the Western drug and combined acupuncture and medicine groups of mice than in the model group (＜0.01,＜0.05).Tremor and depression-relieving prescription combined with acupuncture can raise low striatal DA, NE and 5-HT levels.

Acupuncture; Electroacupuncture; Parkinson disease; Mouse; Tremor and depression-relieving prescription; Combined use of acupuncture and medicine

1005-0957(2011)01-0056-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.01.056

2010-10-28