NGAL在乳腺癌中的表達(dá)及意義

王曉鴻 郭永誼 茍新敏

NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Lipocalin家族的新成員，于1993年在人中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)和分離出來(lái)[1]。近年來(lái)NGAL與人類腫瘤的關(guān)系受到了人們的重視，并在NGAL基因的功能以及NGAL在人體正常和腫瘤組織中的表達(dá)特征方面取得了一些有意義的進(jìn)展。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)60例乳腺癌中NGAL蛋白的表達(dá)水平，探討其在乳腺癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2003～2010年在中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院行初次手術(shù)且有完整臨床病理資料存檔的乳腺癌組織石蠟標(biāo)本60例(術(shù)前均未行化療、放療或生物治療)，中位年齡55歲(36～69歲)。病理分級(jí):G114例，G214例，G332例。病理類型:導(dǎo)管癌28例，小葉癌21例，其他類型11例。手術(shù)病理分期:Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期13例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有轉(zhuǎn)移24例，無(wú)轉(zhuǎn)移36例。正常乳腺組織10例，為同期因其他良性疾病手術(shù)切除的卵巢組織，中位年齡43歲(31～58歲)。以已知胰腺癌陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色證實(shí)診斷。

1.2 主要試劑及檢測(cè)方法 鼠抗人NGAL單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)R＆D公司，免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。采用免疫組織化學(xué)二步法，石蠟切片逐級(jí)脫蠟至水，抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min。PBS沖洗，滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS洗 3次，5 min/次。滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片，光鏡觀察。

1.3 結(jié)果判定 采用IP(intensity+percentages)評(píng)分方法，綜合考慮染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，由兩位病理學(xué)專家獨(dú)立閱片，再討論確定免疫組織化學(xué)結(jié)果。①染色強(qiáng)度計(jì)分，細(xì)胞漿無(wú)染色:0分;淡黃色:1分;棕黃色:2分;棕褐色:3分。②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分。細(xì)胞漿無(wú)染色:0分;染色細(xì)胞數(shù)＜1%:1分;染色細(xì)胞數(shù)1% ～10%:2分;染色細(xì)胞數(shù)10% ～33%:3分;染色細(xì)胞數(shù)33% ～66%:4分;染色細(xì)胞數(shù)＞66%:5分。兩項(xiàng)之和即為總分。陰性(-):＜2分;陽(yáng)性(+)～(+++):2～8分;低表達(dá)(+):2～4分;中等表達(dá)(++):5～6分;高表達(dá)(+++):7～8分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包處理。樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率檢驗(yàn)，所有的統(tǒng)計(jì)分析均分雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 NGAL在不同性質(zhì)的乳腺組織中的表達(dá) 通過(guò)免疫組化檢測(cè)，可見(jiàn)NGAL的表達(dá)定位于上皮細(xì)胞胞漿中。正常上皮中，只有2例可見(jiàn)NGAL微弱的表達(dá)，并且表達(dá)位于細(xì)胞漿內(nèi)靠近細(xì)胞膜的局限區(qū)域，表達(dá)率為10%。60例乳腺癌組織中49例NGAL表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)率為81.7%，多為中、高表達(dá)(++)～(+++);NGAL的陽(yáng)性表達(dá)率在乳腺癌和正常卵巢組織中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 NGAL表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 NGAL蛋白表達(dá)與乳腺癌分化程度、病理類型、臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。NGAL蛋白在分化程度高(G1～G2)的腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為67.9%，在分化程度低(G3)的腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為93.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NGAL在導(dǎo)管型乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)率為96.4%，在小葉型乳腺癌的表達(dá)率為90.5%，在其他類型乳腺癌中的表達(dá)率為90.9%，各種類型間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。NGAL蛋白在乳腺癌早期(Ⅰ～Ⅱ)期腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為68.0%，在晚期(Ⅲ～Ⅳ)腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為91.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NGAL蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為91.7%，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

表1 不同臨床病理指標(biāo)的卵巢癌組織中NGAL蛋白的表達(dá)

3 討論

Lipocalin是一個(gè)有20多種可溶性蛋白組成的大家族。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析證實(shí)，它們均擁有一個(gè)高度保守的由8條反向平行的β折疊形成的桶狀親脂性三級(jí)結(jié)構(gòu)，其可結(jié)合疏水性的小分子形成復(fù)合物，也可與某些細(xì)胞膜受體結(jié)合[2]，在人體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。NGAL作為L(zhǎng)ipocalin家族的一員，其氨基酸序列及DNA內(nèi)含子和外顯子的排列與本家族其他成員有很高的保守性和同源性。這個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)讓該家族成員有能力結(jié)合一些主要是疏水性的小分子物質(zhì)而形成復(fù)合物，甚至還可以在細(xì)胞表面結(jié)合特異性受體[3]。在親脂性小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用，更在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定或免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色。除中性粒細(xì)胞外，正常情況下NGAL蛋白亦可微量表達(dá)與腔道表面組織細(xì)胞，如呼吸系統(tǒng)的肺泡間巨噬細(xì)胞、支氣管上皮單個(gè)黏液細(xì)胞和消化系統(tǒng)的胃壁細(xì)胞、小腸部分潘氏細(xì)胞、肝膽管細(xì)胞、胰小葉內(nèi)和閏管細(xì)胞以及泌尿生殖系統(tǒng)的腎近曲小管細(xì)胞、尿道傘部細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞等[4]。而在病理狀態(tài)下，其表達(dá)程度明顯增強(qiáng)。最初學(xué)者認(rèn)為NGAL可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放，在抗感染中發(fā)揮重要作用[5-7]。最近進(jìn)一步研究通過(guò)NGAL在大鼠小鼠中的同源基因研究證實(shí)，NGAL蛋白可能為一種新的癌基因，在許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)[8]。Stoesz等于1998年就研究發(fā)現(xiàn)，NGAL在乳腺癌組織細(xì)胞中表達(dá)。在大鼠NGAL的同系物NRL被確定為在HER-2/neu癌蛋白所誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生過(guò)程中是唯一表達(dá)上調(diào)的蛋白，可能是介導(dǎo)大鼠乳腺癌發(fā)生的重要分子靶標(biāo)。Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中NGAL/Lipocanlin2的高表達(dá)可能在調(diào)節(jié)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移中具有重要作用，而通過(guò)基因沉默降低NGAL的蛋白水平則能阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Berger等[9]證實(shí)，Lipocanlin2/NGAL基因敲除后，乳腺癌的發(fā)生、腫瘤的增殖程度均明顯降低，但由此引起的肺轉(zhuǎn)移并未受到影響。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NGAL蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤細(xì)胞的S期分?jǐn)?shù)和增殖指數(shù)Ki67呈正相關(guān)[10]。本研究顯示，NGAL蛋白在乳腺癌中顯著表達(dá)，與正常乳腺組織比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，NGAL在乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤的分化程度和手術(shù)病理類型、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)。提示NGAL不僅可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)，而且在腫瘤的進(jìn)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中具有一定作用，但其作用機(jī)制目前尚未明確。而B(niǎo)auer等在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，NGAL的表達(dá)與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良的組織學(xué)分級(jí)、HER-2/neu過(guò)表達(dá)以及類固醇激素受體陰性等高度相關(guān)[10]。NGAL可以與鐵高親和力結(jié)合，介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，上調(diào)鐵易感基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[11-12]。而Shi等用RT-PCR對(duì)鼠的乳腺癌細(xì)胞株4T1研究發(fā)現(xiàn)NGAL不能影響癌細(xì)胞的增殖，但能明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。而在食管癌的研究中發(fā)現(xiàn)，反義封閉NGAL基因表達(dá)后，接種裸鼠的癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低[13]。Yang等證明，NGAL能夠通過(guò)激活ERalpha/Slug信號(hào)通路，調(diào)節(jié)vimentin/fibronectin和E-cadherin的表達(dá)及活性，誘導(dǎo)EMT(epithelial tomesenchymal transition)發(fā)生，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[14]。Fernandez等研究發(fā)現(xiàn)NGAL可能通過(guò)保護(hù)并調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)及活性而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

乳腺癌是女性腫瘤中的一種多發(fā)病，且有高度的家族遺傳性，對(duì)該病的早期診斷、檢測(cè)及干預(yù)具有非常重要的意義。本研究證實(shí)，NGAL可作為乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展、浸潤(rùn)及侵襲等發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的檢測(cè)指標(biāo)及靶點(diǎn)，是評(píng)估腫瘤生物學(xué)特性和預(yù)后的一個(gè)新的參考指標(biāo)。在篩選高?；颊?，指導(dǎo)臨床制定合理治療方案等方面具有積極的意義。

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