反相高效液相色譜法測(cè)定燒傷涂膜中黃芩苷含量

張秋紅，張忠義，王曙東

(1.中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002;2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510282)

燒傷涂膜是醫(yī)院中藥制劑，用于治療深、淺Ⅱ度燒傷[1]，處方中含黃芩和虎杖等。為控制制劑質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法鑒別黃芩[2]，用反相高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量[3-4]，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括Waters 1525雙泵，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Waters Millennium 32色譜工作站(美國Waters公司)。黃芩苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所);燒傷涂膜(醫(yī)院自制，含黃芩、大黃、殼聚糖等);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩薄層色譜鑒別

精密稱取本品20 g，加水100 mL，用稀鹽酸調(diào)pH至2，加乙酸乙酯30 mL，水浴回流提取2 h，收集乙酸乙酯液，酸水層用乙酸乙酯萃取2次，合并提取液，揮干，殘?jiān)右掖? mL溶解，上14～30目聚酰胺柱，先用水洗脫至洗出液無色，再用80%乙醇洗脫，收集洗出液200 mL，回收乙醇，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液;精密稱取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液;取黃芩對(duì)照藥材2 g，加乙醇50 mL，水浴回流提取1 h，濾過，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，用稀鹽酸調(diào)pH至2，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，合并萃取液并揮干，殘?jiān)右掖? mL溶解，上14～30目聚酰胺柱，先用水洗脫至洗出液無色，再用80%乙醇洗脫，收集洗出液200 mL，回收乙醇，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液;按處方稱取除黃芩外的其余藥材，制成涂膜劑，依供試品溶液配制方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水(4 ∶2 ∶1)為展開劑，展開，晾干。日光下呈綠色，紫外光燈(365 nm)下呈褐色。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液則無此斑點(diǎn)(圖1)。

圖1 黃芩薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸(55∶45);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:室溫。

2.2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品5.99 mg，配成質(zhì)量濃度為3.00 g/L的對(duì)照品貯備液。分別取3批樣品各20 g，加水20 mL，用稀鹽酸調(diào)pH至2，加乙酸乙酯20 mL，水浴加熱回流2 h，放冷，取乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液;取不含黃芩的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。黃芩苷的保留時(shí)間約為5.9 min，陰性對(duì)照品溶液在此處無干擾峰，說明對(duì)樣品含量測(cè)定無干擾。理論塔板數(shù)以黃芩苷計(jì)不低于3 000，黃芩苷色譜峰與相鄰未知色譜峰的分離度不低于1.4。色譜見圖 2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品貯備液1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。再精密吸取稀釋液1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，使黃芩苷質(zhì)量濃度分別為 3.000，2.250，1.688，1.266，0.949，0.712 g/L，取10 μL進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=2.93×107C+2.58×106，r=0.998 2(n=6)。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在0.712～3.00 g/L范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密稱取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果黃芩苷峰面積積分值的 RSD為0.97%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，依法測(cè)定峰面積5次，每次間隔1 h。結(jié)果的 RSD=0.43%(n=5)，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批號(hào)的樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果的 RSD=0.93%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，配成質(zhì)量濃度為1.134 g/L的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液。另精密稱取樣品(批號(hào)為091027)10 g，共6份，分別加入上述標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液0.7，1.0，1.2 mL，按供試品溶液制備方法制成加樣回收樣品液，取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

依法測(cè)定3批樣品，結(jié)果黃芩苷含量分別為113.7，113.6，113.7 μg/g。

3 討論

薄層色譜法是含黃酮類成分中藥制劑最常用的定性分析方法。一般采用吸附薄層色譜，常用的吸附劑為硅膠與聚酰胺。聚酰胺特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類，黃芩苷正是含有游離酚羥基的黃酮苷類，故在樣品提取過程中使用聚酰胺柱吸附黃酮苷。洗脫時(shí)先用水洗去雜質(zhì)，再用80%乙醇洗脫黃芩苷，以使鑒別效果理想。

關(guān)于高效液相色譜法測(cè)定黃芩中黃酮苷類成分的報(bào)道較多，多采用流動(dòng)相梯度洗脫，且都選擇水、乙腈和無機(jī)酸類。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇、水和磷酸組成的流動(dòng)相分離效果理想，且更為經(jīng)濟(jì)。筆者通過二級(jí)管陣列檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行光譜掃描，提取各組分在不同波長(zhǎng)處的三維光譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，最后選280 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)處被測(cè)組分有靈敏的響應(yīng)值，同時(shí)此波長(zhǎng)也是測(cè)定黃芩苷時(shí)雜質(zhì)峰干擾最小處。

[1]解偉光.燒傷患者能量消耗的基本變化[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2007，20(3):269-271.

[2]劉英學(xué)，劉中剛，蘇 蘭，等.黃芩化學(xué)成分研究[J].中國藥物化學(xué)雜志，2009，19(1):59-62.

[3]張守堯，郭友立，王秉鈞，等.微乳液相色譜法測(cè)定黃芩苷的含量[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(1):179-180.

[4]湯小蕾，孫平飛.HPLC法測(cè)定黃芩分散片中黃芩苷的含量[J].中藥材，2009，32(9):1 471-1 472.