具抑菌活性的魚腥草內(nèi)生細(xì)菌的篩選＊

胡汝曉，謝丙炎，譚周進，王春暉

(1.湖南省食用菌研究所，湖南 長沙 410013;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208)

魚腥草為三白草科多年生草本植物蕺菜 Houttuynia cordate Thunb.帶根全草，又名側(cè)耳根、紫蕺、豬鼻孔、九蓮草等，廣泛分布于我國中部、東南及西南各省區(qū)，具有抗菌、抗病毒、清熱解毒、消癰排膿、尿通淋之功效，中醫(yī)用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒等病癥[1]。植物內(nèi)生菌可從多個層面影響其化學(xué)成分:獨自合成化學(xué)物質(zhì)[2-4]，協(xié)助植物合成化學(xué)物質(zhì)[5-6]，影響植物合成與降解化學(xué)物質(zhì)[2，5，7-8]。此外內(nèi)生菌整體對植物化學(xué)成分也有影響[9]，還可從進化水平上影響植物的化學(xué)成分[3，10]。從具有獨特藥用價值或生物多樣性較為豐富地區(qū)生長的植物中較易分離出具有特殊代謝產(chǎn)物的菌株[11-14]，同時能克服植物資源的不足，而魚腥草正可滿足這些要求。魚腥草素對卡他球菌、溶血性鏈球菌、流感桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯的抑制作用[15]。魚腥草含有大量的內(nèi)生菌，在尋找抗性微生物時，莖內(nèi)生菌具有一定的優(yōu)勢[16]。因此，筆者以莖內(nèi)生細(xì)菌為篩選抗性菌的重點，希望找到一些能合成魚腥草素或其類似物的具有開發(fā)潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CR21G型高速冷凍智能離心機(日本日立公司);UV-2100型雙光束紫外/可見分光光度計(中國北京瑞利分析儀器公司)。接種和培養(yǎng)儀器為國產(chǎn)，培養(yǎng)基Ⅰ配方為牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂 1.8 g，蒸餾水 100 mL，pH=7.0 ～7.6;培養(yǎng)基Ⅱ為培養(yǎng)基Ⅰ不加瓊脂[17]。所用試劑為國產(chǎn)分析純。魚腥草采自湖南長沙周邊菜園，生長環(huán)境為地下水位高、常年潮濕的地塊;大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本實驗室提供。

1.2 內(nèi)生菌分離

將魚腥草連根挖起，先洗凈根上泥土，再沖洗整株，室溫下涼干表面明水，用無菌剪刀將根莖葉剪開，各取5 g，用75%酒精表面消毒5 min，然后用無菌水沖洗5次，取最后一次沖洗液(0.1 mL)涂布培養(yǎng)基Ⅰ平板，28℃下培養(yǎng)24 h，作為空白對照。在無菌條件下加10 mL無菌的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH=7.8，W/V=1/2)碾磨樣品，充分振蕩15 min，以此為母液，梯度稀釋至10-1，10-2，10-3，吸取菌液(0.1 mL)涂布培養(yǎng)基Ⅰ平板，28℃下培養(yǎng)24 h，根據(jù)外觀形態(tài)特征，挑選單菌落一步純化，做初步鑒定并保存。

1.3 點接法抑菌試驗[18]

取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，用培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)，無菌操作，挑取適當(dāng)菌量到裝有無菌水的試管，打散搖勻制成菌懸液，取0.2 mL該菌懸液涂布培養(yǎng)基Ⅰ空白平板，放置20～30 min(至平板表面無明顯菌液)，作為檢測平板備用。用接種環(huán)挑起芝麻大小的被檢菌，接到檢測平板上，28℃下培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈。抑菌效果強弱用抑菌圈內(nèi)外徑之比表示。

1.4 發(fā)酵液濾紙片法抑菌試驗[18]

取點接效果最好的一株菌株進行研究。具體操作為按檢測平板制作方法制取檢測平板。用培養(yǎng)基Ⅱ?qū)⒛繕?biāo)菌在30℃和145 r/min條件下培養(yǎng)72 h(或處理后發(fā)酵液)，用細(xì)菌過濾器(孔徑為0.22 μm)過濾，用3層無菌干燥的小濾紙片(直徑為6 mm)蘸取無菌發(fā)酵液，置檢測平板上，28℃下培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈，用抑菌圈外徑 d(mm)表示抑菌作用強弱。

1.5 抗菌物質(zhì)初步鑒定試驗

發(fā)酵液制取:將目標(biāo)菌接入培養(yǎng)基Ⅱ，在30℃和145 r/min條件下培養(yǎng)72 h，以 5 000 r/min轉(zhuǎn)速(R20A2)離心 10 min，取上清液。

耐溫試驗:200 mL 發(fā)酵液，分別在 60，70，75，80，90 ℃下處理10 min，用濾紙片法做抑菌試驗。

抗菌物質(zhì)透析試驗:取200 mL發(fā)酵液，裝于5 000 Da透析袋，放入聚乙二醇(PEG-6000)中，4℃下濃縮至1/10體積，再在4℃蒸餾水中透析至AgNO3檢測無沉淀(18 h)，取透析袋中蛋白溶液，用濾紙片法做抑菌試驗。

光吸收試驗:取1 000 mL發(fā)酵液，55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL，加300 mL無水乙醇，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速(R12A3)離心10 min，取上清，55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL，以培養(yǎng)基Ⅱ同法操作溶液作為參比液校正基線，在200～800 nm波長范圍內(nèi)以2 nm為間隔進行掃描。將做完光吸收試驗的溶液再在55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固體，加50 mL蒸餾水溶解，用濾紙片法做抑菌試驗。

1.6 種屬鑒定試驗

按文獻[17]方法，做目標(biāo)菌的菌落形態(tài)，革蘭氏染色和芽胞染色，鞭毛染色和細(xì)菌大小測定，糖、醇、糖苷類碳源的分解，淀粉水解，過氧化氫酶，明膠液化等試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草內(nèi)生菌的抗菌性特點

本試驗分離出200個細(xì)菌菌株，由點接法測得結(jié)果。魚腥草內(nèi)生菌的抗菌性特點見表1?？梢?，剛分離時抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌株數(shù)比較接近，保存6個月并培養(yǎng)數(shù)代后抗菌菌株有所減少，且對大腸桿菌的抗性較易喪失，這就要求在篩選菌株中應(yīng)重點關(guān)注對大腸桿菌抗性的穩(wěn)定性。同時，可發(fā)現(xiàn)魚腥草內(nèi)生菌對兩種菌的抗性具有連鎖性，說明找到同時抗兩種菌的物質(zhì)是可能的。經(jīng)點接法初選、濾紙片復(fù)選，筆者以抑菌圈內(nèi)外圈之比、抑菌是否徹底、抑菌穩(wěn)定性和形態(tài)差異性等為指標(biāo)，從200個菌株中選出1個各項指標(biāo)表現(xiàn)均較優(yōu)良的細(xì)菌菌株。

表1 魚腥草內(nèi)生菌的抗菌性特點[株(%)]

2.2 目標(biāo)菌抗菌能力

由表2可見，目標(biāo)菌抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的能力(抑菌圈內(nèi)外徑之比)分別為3.28和3.8，由于不同菌株在相同培養(yǎng)條件下菌落直徑有較大差異(2～11 mm)，因此篩選抗性菌株時不能只考慮抑菌圈內(nèi)外徑之比，對抑菌圈內(nèi)徑較大的菌株，還得考慮內(nèi)外徑之差。所選菌株菌落直徑為5～7 mm。試驗還表明，有些目標(biāo)菌在對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用的同時，大腸桿菌或金黃色葡萄球菌對目標(biāo)菌也有一定的抑制或促進作用，即目標(biāo)菌在抑菌試驗中的菌落大小與純培養(yǎng)試驗中菌落大小(培養(yǎng)條件相同)有明顯差異。

表2 目標(biāo)菌抑菌能力

2.3 目標(biāo)菌發(fā)酵液抑菌能力

以濾紙片法抑菌試驗的抑菌效果差異不大，約為10 mm(濾紙片直徑6 mm)。這主要是因為濾紙片所蘸發(fā)酵液量比較一致，放到無水平板上時，發(fā)酵液擴散直徑比較一致，所以抑菌物質(zhì)作用的范圍也比較一致，但在作用時間以及抑菌是否徹底上存在較大差異。所選菌株抑菌時間在5 d以上，且抑菌徹底。

2.4 抗菌物質(zhì)光吸收特性

發(fā)酵液光吸收特征見圖1?？梢姡摼臧l(fā)酵液的初提液在魚腥草素最大吸收峰283 nm波長[19-20]附近有特征吸收峰，說明目標(biāo)菌確實分泌物質(zhì)到發(fā)酵液中，至于該物質(zhì)是不是抑菌物質(zhì)、是何種物質(zhì)，還有待于進一步研究。

圖1 發(fā)酵液光吸收特征

2.5 抑菌物質(zhì)初步鑒定結(jié)果

耐溫試驗表明，抗菌物質(zhì)對高溫有較好的耐受性，在90℃水浴中10 min活性無明顯變化。透析試驗表明，發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)濃縮再透析后，透析袋中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)無抑菌活性，說明抑菌物質(zhì)為能透過透析袋的小分子物質(zhì)，而不是留在透析袋中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。結(jié)合耐溫試驗結(jié)果，可以初步判定該菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)不是常規(guī)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。經(jīng)光吸收試驗初處理后的提液基本上沒有失去抗菌活性，即抗菌物質(zhì)在初處理過程中大量保留于提取液中。

2.6 種屬鑒定

目標(biāo)菌菌落形態(tài)為煎餅狀、不透明、褐色、表面濕潤、邊緣完整的直徑為2 mm的圓形菌落;革蘭染色、芽胞染色陽性，鞭毛染色陰性細(xì)菌大小為 0.75 μm ×2.4 μm;葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖反應(yīng)陽性，甘露醇反應(yīng)陰性;淀粉水解試驗陽性;過氧化氫酶試驗陽性;明膠液化試驗陽性。根據(jù)細(xì)菌分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)可知，目標(biāo)菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)[21]。

3 討論

本試驗沒采用最優(yōu)稀釋濃度，而是采用最大濃度范圍，即只要有單菌落出現(xiàn)就進行分離，而不管該平板上菌落是否出現(xiàn)相連情況。這主要基于在分離過程中內(nèi)生菌可能繁殖，而這種體外繁殖的菌株間速率比與體內(nèi)繁殖的菌株間速率比可能不同，即分離過程表現(xiàn)為的優(yōu)勢菌落可能并非實際的優(yōu)勢菌。同時尤其注重相似菌株的篩選，如果兩菌大部分形態(tài)指標(biāo)相似，但有一兩個形態(tài)指標(biāo)明顯不同，即被成對選出，并在后期試驗中進行對比研究。

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