溫陽通絡(luò)方對硬皮病成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原及MMP-1mRNA的影響

謝志軍 曹靈勇 溫成平 范永升 浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

卞 華 河南南陽理工學院醫(yī)學院

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic seleroderma，SSc）是一種以彌漫性皮膚增厚和纖維化為主要臨床特征、可影響內(nèi)臟的難治性結(jié)締組織病。細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積，是其重要環(huán)節(jié)之一[1-3]。我們臨床應用溫陽通絡(luò)方治療該病，取得一定療效，并采用血清藥理學方法探討該方對硬皮病患者皮損組織成纖維細胞膠原合成的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 含藥血清制備 12例SSc患者分成SSc對照組（初診未治療者）、西藥組、中藥組、中西藥聯(lián)合組，每組3例。西藥組口服青霉胺（1次0.125g，1天3次）和強的松（1次20mg，1天1次）；中藥組給予溫陽通絡(luò)方煎劑（基本方：黃芪15g，桂枝10g，仙靈牌、桃仁各12g，丹參20g，積雪草12g，白芥子10g，香附15g，全蝎 3g。水煎服，1天 1劑，早晚各 1次）。中西藥聯(lián)合組給予青霉胺、強的松和溫陽通絡(luò)方煎劑（劑量、用法與西藥組、中藥組相同）。療程均2個月。

空腹抽取SSc對照組患者靜脈血，經(jīng)2000r/min離心15min，分離血清，56℃水浴滅活補體，-20℃保存?zhèn)溆?；西藥組、中藥組、中西藥聯(lián)合組經(jīng)治療2個月后，空腹抽取靜脈血，血液標本處理同上，制備含藥血清。

1.2 皮膚成纖維細胞系原代培養(yǎng) 在局麻無菌條件下，分別切取一名24歲男性包皮過長者的正常包皮和一名36歲女性肢端型SSc患者腹股溝處活動性硬化皮損組織，剪去表皮及皮下脂肪組織，將組織塊反復剪碎成漿，梅花狀滴入25mL的培養(yǎng)瓶中，各點間距約0.5cm，再加入含20%的DMED培養(yǎng)基1.5mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，4～6h貼壁后，使培養(yǎng)基浸入真皮皮漿，繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的正常皮膚和SSc皮膚成纖維細胞，配成終濃度為5×l06/mL細胞懸液。轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個復孔，37℃、5%CO2濃度及100%濕度培養(yǎng)箱中孵育24h，待細胞貼壁后，吸出上清液，無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞同步化。然后分別加入20%的SSc對照組血清或各處理組含藥血清（血清濃度為經(jīng)預實驗摸索后確定的有效濃度），正常對照組給予20%正常血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 引物設(shè)計 首先在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/的“nucleotide”中查詢?nèi)烁髂康幕蛉玞DNA序列；采用Primer5.0軟件進行目的基因序列的上、下游引物設(shè)計，然后在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的nucleotide blast中進行blast程序比對。最后確定的上下游引物序列見表1。

表1 CDNA上下游引物序列

引物稀釋：將訂購的引物EP管分別經(jīng)10000r/min離心5s后加入DEPC水各200μL，然后將上下游引物混合，-20℃保存?zhèn)溆?。Oligo dT及 MML-V 10000r/min離心5s，Oligo dT離心后加入300μL DEPC水配成50pmol/μL濃度的工作液。

1.4 SSc成纖維細胞總RNA提取 上述細胞經(jīng)加入不同含藥血清20%培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，棄去上清液，每孔分別加入消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA

各lmL），配成濃度為3×106/mL細胞懸液，TRIzol試劑一步法提取總RNA。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA及PCR擴增 逆轉(zhuǎn)錄體系總體積為25μL，反應體系如下：總RNA 2μL、Oligo（dT）5μL、5×M-MLV Buffer4μL、dNTP（2.5mM） 6μL、Rnase Inhibitor 0.5μL、M-MLV 0.5μL， 加 ddH2O（DEPC處理）至25μL，42℃水浴箱反應 1h，再取cDNA產(chǎn)物與上述上、下游引物進行PCR擴增。

1.6 DNA電泳及圖像分析 取上述PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后以BIO-RAD凝膠成像儀紫外光下拍照，圖像分析軟件進行光密度分析，以β-actin作為內(nèi)參照。最后以目的基因的相對轉(zhuǎn)錄量為參數(shù)進行半定量統(tǒng)計分析。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 以SPSS16.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以（） 表示，方差齊性檢驗采用Levene檢驗，多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與正常皮膚比較，SSc患者皮損組織成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達量明顯增多（P＜0.01）；與SSc對照組比較，20%不同含藥血清處理后各處理組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達量明顯減少（P均＜0.01）；中藥組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達量顯著高于西藥組和中西藥組（P均＜0.01），中西藥組顯著低于西藥組（P＜0.01）。各組SSc皮膚成纖維細胞MMP-1mRNA表達量明顯高于正常對照組（P均＜0.01）；各組間SSc皮膚成纖維細胞MMP-1mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2，圖 1～3。

表2 各組I、III型膠原及MMP-1mRNA表達量比較（，n=3）

表2 各組I、III型膠原及MMP-1mRNA表達量比較（，n=3）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與 SSc對照組比較，△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.01

組 別 I型膠原 III型膠原 MMP-1 SSc對照組 0.771±0.016*▲ 0.808±0.017*▲ 0.547±0.017*西藥組 0.468±0.011*△ 0.509±0.011*△ 0.523±0.014*中藥組 0.686±0.013*△▲ 0.564±0.014*△▲ 0.537±0.015*中西藥組 0.462±0.012*△▲ 0.219±0.009*△▲ 0.525±0.014*正常對照組 0.180±0.009△▲ 0.175±0.007△▲ 0.487±0.013

圖1 各組成纖維細胞Ⅰ型膠原mRNA相對表達量

圖2 各組成纖維細胞Ⅲ型膠原mRNA相對表達量

圖3 各組成纖維細胞MMP-1mRNA相對表達量

3 討 論

SSc 屬中醫(yī)“皮痹”、“血痹”、“肌痹”、“臟腑痹”等范疇?！端貑枴け哉摗吩疲骸氨栽诠莿t重，在于脈則血凝不流，在于筋則屈不伸，在于肉則不仁，在于皮則寒”?！吨T病源候論》謂：“風濕痹之狀或皮膚頑厚……風寒濕三氣雜至合而為痹，由氣血虛又受風濕而成此病，久不愈入經(jīng)絡(luò)”。中醫(yī)認為，該病因陽氣不足，風寒乘虛侵襲，凝結(jié)于經(jīng)絡(luò)，氣血凝滯，閉塞不通而發(fā)病。病機關(guān)鍵在于正虛、寒凝和血瘀，屬本虛標實。鑒此，我們確定溫陽祛瘀法，以標本兼治。溫陽通絡(luò)方中黃芪能“榮筋骨”，療“賊風之病，偏中血脈，而手足不隨著”（《本草匯言》）；桂枝能“開腠理，解表，去皮風濕”（《主治秘訣》），“散風寒，去肢節(jié)間風痛”（《本草匯言》），且善入血分，為溫通血脈之要藥；桃仁“治皮膚凝聚之血”（《本草備要》），“主血滯風痹”（《本草綱目》）；丹參能“養(yǎng)血，去腰脊強，腳痹”（《名醫(yī)別錄》），“療風痹”（《本草經(jīng)集注》）。藥理研究表明，黃芪可促進T細胞的分化和成熟，擴張血管，降低血小板黏附率，減少血栓形成，抗缺氧等。桂枝能抗炎，增加冠狀動脈血流量。桃仁具有改善血流變學，抗炎、抗過敏等作用。丹參能擴張冠狀動脈，改善血液流變性，降低血液黏稠度，抑制凝血，抑制血小板聚集及黏附[4]。丹參還能抑制成纖維細胞的增殖和膠原合成[5-6]。因此，溫陽祛瘀法治療SSc可能以改善微循環(huán)及結(jié)締組織代謝為主要環(huán)節(jié)，對免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌起到調(diào)節(jié)性作用。

正常情況下，ECM合成與降解處于動態(tài)平衡。Jelaska等[7]證明SSc中部分皮膚成纖維細胞被激活，其I型前膠原mRNA表達明顯增多。Zurita-satinas等[8]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的SSc皮損成纖維細胞的膠原合成與正常對照組相比具有顯著性差異。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)顯示，SSc患者皮損組織成纖維細胞I、III型膠原mRNA表達明顯多于正常皮膚，說明SSc患者成纖維細胞的膠原合成量增加，提示結(jié)締組織的異常代謝是SSc發(fā)病機制的一個重要環(huán)節(jié)，溫陽祛瘀藥物在一定程度上干擾SSc患者皮膚成纖維細胞I、III型膠原mRNA的表達，而對膠原酶的干預作用不明顯，其機制有待進一步深入研究。

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