抗氧化劑對(duì)金槍魚(yú)肉凍藏過(guò)程中組胺的抑制作用

姜李雁，王 霞，王 佩，鄭平安，高 翔，蔣 鑫，蘇秀榕*

抗氧化劑對(duì)金槍魚(yú)肉凍藏過(guò)程中組胺的抑制作用

姜李雁，王 霞，王 佩，鄭平安，高 翔，蔣 鑫，蘇秀榕*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

利用C18柱、紫外檢測(cè)器的高效液相色譜建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)金槍魚(yú)魚(yú)肉中組胺含量的方法和技術(shù)，并對(duì)抗氧化劑對(duì)金槍魚(yú)儲(chǔ)藏過(guò)程中組胺產(chǎn)生的抑制作用進(jìn)行研究。對(duì)不同部位的魚(yú)肉采用不同抗氧化劑浸泡處理，檢測(cè)不同儲(chǔ)藏時(shí)間下組胺含量的產(chǎn)生和變化。結(jié)果表明：該方法的線性回歸方程為Y=5.3748X＋11.42，線性范圍為10～1000μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9986，加標(biāo)回收率為92.0%～111.3%，檢出限為3.684μg/mL，用于實(shí)際樣品測(cè)定操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確靈敏、適用性強(qiáng)、結(jié)果滿(mǎn)意；經(jīng)抗氧化劑處理的金槍魚(yú)魚(yú)肉中組胺含量明顯低于未經(jīng)處理的，其中異VC鈉和檸檬酸鈉混合溶液的浸泡效果最好、VC鈉次之、檸檬酸鈉最差?？寡趸瘎┘瓤梢苑乐菇饦岕~(yú)魚(yú)肉氧化變黑，又可有效降低組胺的產(chǎn)生。

高效液相色譜；組胺；金槍魚(yú)；抗氧化劑

金槍魚(yú)(Thunnus thynnus)是一種生活在海洋中上層的魚(yú)類(lèi)，分布在太平洋、大西洋和印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶廣闊水域，為高度跨洋性的洄游魚(yú)類(lèi)。金槍魚(yú)肉質(zhì)柔嫩，富含蛋白質(zhì)、DHA和EPA，其背部肌肉粗蛋白含量為26.0%[1]。金槍魚(yú)作為一種深海魚(yú)類(lèi)，以其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、純天然、無(wú)污染而享譽(yù)國(guó)際市場(chǎng)，有“海洋黃金”之稱(chēng)。由于金槍魚(yú)肉中含有豐富的血紅蛋白和肌紅蛋白，在有生命活動(dòng)的組織內(nèi)，肌紅蛋白與肌紅蛋白處于平衡狀態(tài)，而魚(yú)體死后經(jīng)氧化生成的高鐵肌紅蛋白則呈現(xiàn)不良的棕紅色[2]。一般認(rèn)為，肌紅蛋白的化學(xué)狀態(tài)是影響?hù)~(yú)肉顏色的根本所在[3]。同時(shí)由于魚(yú)肉中的組氨酸在組胺細(xì)菌脫羧酶的作用下，發(fā)生脫羧反應(yīng)生成組胺[4]。海水中存有污染魚(yú)類(lèi)的組胺菌，組胺生成菌普遍存在于海水魚(yú)的體表，也生活在活魚(yú)的鰓和內(nèi)臟中。當(dāng)魚(yú)體存活時(shí)，該細(xì)菌不對(duì)魚(yú)產(chǎn)生危害。一旦魚(yú)死亡，魚(yú)的防御系統(tǒng)就破壞，在適宜溫度條件下，組胺菌就迅速生長(zhǎng)并產(chǎn)生組胺。金槍魚(yú)是常見(jiàn)的產(chǎn)組胺魚(yú)類(lèi)，又是易變黑的紅肉魚(yú)。本實(shí)驗(yàn)擬研究可食用的抗氧化劑在凍藏條件下對(duì)金槍魚(yú)肉中的組胺變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金槍魚(yú)(凍藏) 寧波今日食品有限公司。

磷酸組胺 上海求德生物化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸、異VC鈉、乙腈均為色譜純；檸檬酸鈉為分析純。

1120LC高效液相色譜(附帶紫外檢測(cè)器) 美國(guó)安捷倫公司；Cary 50 scan紫外分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安技術(shù)(中國(guó))有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

金槍魚(yú)肉在低溫條件下采集，背部與腹部魚(yú)肉各分成4份。樣品Ⅰ：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%異VC鈉浸泡2～3h；樣品Ⅱ：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%異VC鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%檸檬酸鈉混合溶液浸泡2～3h；樣品Ⅲ：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%檸檬酸鈉浸泡2～3h；樣品Ⅳ：未浸泡。所有樣品浸泡2～3h之后，在-20℃條件下凍藏。

稱(chēng)取切碎的樣品1.0g，放入15mL帶塞試管中，加入50%甲醇溶液5mL。超聲波萃取30min，然后在60℃水浴中放置15min，靜置后用移液管移取上清液至4mL離心管中，在6500r/min條件下離心10min，取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，取2μL進(jìn)樣。

1.2.2 液相色譜分析

1.2.2.1 組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制10～90μg/mL的系列組胺標(biāo)準(zhǔn)液，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液并計(jì)算其峰面積A值。以A值為縱坐標(biāo)、A所對(duì)應(yīng)的各質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 色譜條件

XDB-C18柱(4.6mm×150mm)的色譜柱。流動(dòng)相A為25mmol/L磷酸氫二鈉(8.4g/L，pH6.5)，流動(dòng)相B為色譜純乙腈，流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(80:20，V/V)；流速為0.5mL/min；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm；進(jìn)液量為2μL；柱溫為30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜檢測(cè)結(jié)果

在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行波長(zhǎng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)組胺在225nm波長(zhǎng)處吸收最強(qiáng)，信號(hào)干擾小，因此選定檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。幾種流動(dòng)相比例均能使色譜峰分離，但隨著比例的不同，峰面積也不同。當(dāng)流動(dòng)相A:流動(dòng)相B為20:80時(shí)，峰面積達(dá)到最大值，組胺檢測(cè)靈敏度高，色譜峰分離較好，保留時(shí)間適宜。

組胺吸收峰的面積隨柱溫的升高而增大，當(dāng)柱溫達(dá)到30℃時(shí)，色譜峰面積達(dá)到最大值，柱溫繼續(xù)升高，峰面積劇減。

選1mg/mL和2mg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種溶液測(cè)定7次，取平均值，其RSD(精密度)值分別為0.83%和1.13%，有較好的精密度(表1)。以信噪比(RSN)為3條件下相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度定為檢出限，計(jì)算得到該方法的檢出限為3.684μg/mL。

表1 高效液相法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7)Table 1 Precision test results for the developed HPLC method

2.2 金槍魚(yú)魚(yú)肉組胺含量變化

表2 不同處理?xiàng)l件對(duì)金槍魚(yú)背部肉中組胺變化的影響Table 2 Effect of different antioxidant treatments on histamine content of tuna back meat

表3 不同處理?xiàng)l件對(duì)金槍魚(yú)腹部肉中組胺變化的影響Table 3 Effect of different antioxidant treatments on histamine content of tuna belly meat

從表2、3可知，不同處理?xiàng)l件下，組胺含量隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增長(zhǎng)而增加。經(jīng)過(guò)比較，未經(jīng)浸泡處理的金槍魚(yú)魚(yú)肉中的組胺含量高于3種經(jīng)浸泡處理的。用0.3%異VC鈉和0.3%檸檬酸鈉混合溶液浸泡效果最好，其次是0.3%異VC鈉浸泡，再次是0.3%檸檬酸鈉浸泡。未經(jīng)浸泡金槍魚(yú)魚(yú)肉的組胺含量均極顯著高于其他3組(P＜0.01)，其他經(jīng)抗氧化劑浸泡處理的3組，組胺含量明顯降低，特別是經(jīng)異VC鈉浸泡處理的，效果非常明顯，說(shuō)明經(jīng)抗氧化劑可有效抑制組胺的產(chǎn)生。

3 討 論

3.1 液相色譜法檢測(cè)組胺的比較

目前檢測(cè)生物樣品中組胺常用的方法有紫外分光光度計(jì)法、熒光分光光度計(jì)法、酶聯(lián)免疫法[5]、高效液相色譜法[6-7]等。熒光法操作步驟繁瑣，且難以去掉干擾，但仍是目前國(guó)際上認(rèn)可的方法；酶聯(lián)免疫法測(cè)定步驟簡(jiǎn)便，但檢測(cè)靈敏度較低；高效液相色譜法靈敏度較高，使用一些國(guó)產(chǎn)儀器及耗材相對(duì)較經(jīng)濟(jì)，通過(guò)方法改進(jìn)，應(yīng)能取得良好的效果。

本研究采用液相色譜法檢測(cè)組胺，用超聲波萃取樣品，提取步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，提取率和回收率高。采用C18柱，紫外檢測(cè)器，可不用進(jìn)行繁瑣的衍生化，保留時(shí)間小于4min，檢測(cè)時(shí)間短、精密度高。線性回歸方程為Y=53748X＋11.42，線性范圍為10～1000μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9986，加標(biāo)回收率為 92.0%～111.3%，檢出限為3.684μg/mL。本法與傳統(tǒng)的分光光度計(jì)法、熒光法等比較，具有檢測(cè)極限低、線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)、回收率高、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 抗氧化劑對(duì)組胺的抑制作用

食品抗氧化劑是能減緩或防止氧化作用、防止食品成分氧化變質(zhì)的一類(lèi)食品添加劑。主要用于防止油脂及富脂食品的氧化酸敗，以及由氧化所導(dǎo)致的褪色、褐變、維生素破壞等[8]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，有一些抗氧化劑除了具有抗氧化作用以外，還對(duì)多種微生物有抑制作用[9-10]。

動(dòng)物性食物中普遍存在組氨酸，尤其是一些青皮紅肉的魚(yú)類(lèi)，其肌肉中含血紅蛋白較多，組氨酸含量也較高當(dāng)受到含高活性組氨酸脫羧酶的細(xì)菌污染后，可使魚(yú)肉中的游離組氨酸脫羧基形成組胺[11]。經(jīng)抗氧化劑浸泡后的金槍魚(yú)魚(yú)肉在凍藏期間與未經(jīng)浸泡的魚(yú)肉比較，其組胺含量顯著降低，說(shuō)明抗氧化劑可以有效的抑制金槍魚(yú)魚(yú)肉在凍藏過(guò)程中組胺的產(chǎn)生?？寡趸瘎┏丝寡趸矫娴墓δ?，國(guó)外報(bào)道[12-13]其還具有抑菌作用。以異VC鈉和檸檬酸鈉混合浸泡效果最好，其次是用異VC鈉浸泡，檸檬酸鈉浸泡效果最差。有研究報(bào)道，水產(chǎn)品中的組胺與細(xì)菌的污染程度有關(guān)，且與相應(yīng)的酶的活性有關(guān)?？寡趸瘎┚哂袣⒕淖饔?，可以抑制甚至殺死魚(yú)肉中的部分含高活性組氨酸脫羧酶的細(xì)菌，同時(shí)抑制某些利于組胺產(chǎn)生酶的活性，從而有效抑制組胺的產(chǎn)生。這些抗氧化劑既可以防止魚(yú)肉氧化變黑，又可以有效降低組胺的產(chǎn)生。

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Inhibition Effect of Antioxidants on Histamine Generation in Tuna during Frozen Storage

JIANG Li-yan，WANG Xia，WANG Pei，ZHENG Ping-an，GAO Xiang，JIANG Xin，SU Xiu-rong*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

A quick and accurate method for the determination of histamine content in tuna was proposed using high performance liquid chromatography with C18column and UV detector. Besides, fish meat from different parts of tuna was soaked in aqueous solutions containing sodium D-isoascorbate alone, sodium citrate alone, or both of them for 2-3 h before -20 ℃ storage, and the production of histamine was measured during the storage. The linear regression equation of the proposed method was obtained as follows: Y = 5.3748X＋11.42, of which the linear range was between 10μg/mL and 1000μg/mL. The detection limit of the method was 3.684 μg/mL. This method is a simple, accurate and widely applicable method, and has been used to determine real samples with satisfying results. Antioxidant-treated tuna meat revealed a much lower level of histamine than its untreated counterpart. Among three treatment ways, combination of the two antioxidants best inhibited the production of histamine, followed by sodium D-isoascorbate alone, and the inhibition effect of sodium citrate alone was the worst. Our results demonstrated that antioxidant treatment not only prevented tuna meat from becoming dark due to oxidation, but effectively inhibited the production of histamine as well.

high performance liquid chromatography (HPLC)；histamine；Thunnus obesus；antioxidants

TS254

A

1002-6630(2011)04-0255-03

2010-10-09

浙江省重中之重學(xué)科項(xiàng)目；寧波市重大(重點(diǎn))科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2010C0125)；寧波大學(xué)優(yōu)勢(shì)特色學(xué)科項(xiàng)目

姜李雁(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：jly198605@126.com

*通信作者：蘇秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程、生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn