2只繁育期雌性大熊貓尿中雌二醇、孕酮含量的變化*

趙鵬鵬,張 強(qiáng),沈潔娜,徐光嵐,侯 佳,馬清義,賈康勝,金學(xué)林,靳亞平

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100;2.陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心,陜西周至 710402)

2只繁育期雌性大熊貓尿中雌二醇、孕酮含量的變化*

趙鵬鵬1,2,張 強(qiáng)2,沈潔娜2,徐光嵐2,侯 佳2,馬清義2,賈康勝2,金學(xué)林2,靳亞平1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵 712100;2.陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心,陜西周至 710402)

利用酶聯(lián)免疫技術(shù)對(duì)陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心2只雌性大熊貓發(fā)情期、圍產(chǎn)期尿中雌二醇、孕酮生殖激素進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明,在發(fā)情期雌二醇值達(dá)到峰值后的24 h內(nèi)對(duì)大熊貓進(jìn)行人工授精受孕成功的幾率較大,雌二醇變化規(guī)律與發(fā)情行為的變化規(guī)律存在一致性;產(chǎn)前孕酮值在峰值后開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降,當(dāng)孕酮值下降至谷底當(dāng)日或次日分娩。

大熊貓;酶聯(lián)免疫;雌二醇;孕酮

大熊貓屬于季節(jié)性單次發(fā)情動(dòng)物,每年3月～5月份發(fā)情一次,屬于“三難”動(dòng)物(發(fā)情難、配種受孕難、育幼成活難)[1]。雌性大熊貓的發(fā)情鑒定和妊娠診斷技術(shù)是解決大熊貓繁殖成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著生殖激素研究的不斷發(fā)展,對(duì)大熊貓生殖激素進(jìn)行測(cè)定已經(jīng)成為提高大熊貓發(fā)情鑒定水平、早期懷孕診斷及進(jìn)行生殖生理基礎(chǔ)理論研究的重要方法。許多學(xué)者利用生殖激素測(cè)定在大熊貓的發(fā)情、排卵和配種及妊娠診斷方面做了大量探討和研究工作,意在探索和掌握大熊貓的繁殖規(guī)律,解決“三難”問(wèn)題。但在大熊貓的確切排卵時(shí)間和適時(shí)配種上,國(guó)內(nèi)外尚未達(dá)成一致意見(jiàn)[2]。

陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心針對(duì)大熊貓秦嶺亞種[3]繁殖難題,利用酶聯(lián)免疫法對(duì)大熊貓尿液中的雌二醇、孕酮等進(jìn)行了測(cè)定分析,并結(jié)合陰道黏膜色澤和行為變化等開(kāi)展了相關(guān)研究工作,旨在為提高大熊貓繁育水平,促進(jìn)大熊貓秦嶺亞種保護(hù)起到了一定積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 1號(hào)大熊貓,5歲,體重90 kg,無(wú)繁育史,第1次人工授精前44 d出現(xiàn)輕微的發(fā)情表現(xiàn),食欲減退。至前人工授精7 d,每天僅攝取約1 kg水果,出現(xiàn)嬉水、后退翹尾、蹭陰等典型的發(fā)情行為,陰門外翻、色澤潮紅,試情不接受。至配種前1 d,發(fā)情行為未見(jiàn)明顯改變,外陰色澤變淡,與種公獸合籠不接受交配,當(dāng)日進(jìn)行人工授精。24 h內(nèi)分合適時(shí)間段再次進(jìn)行人工授精2次。產(chǎn)前35 d出現(xiàn)輕微的行為變化,有挑食現(xiàn)象。至產(chǎn)前18 d不吃竹子,喜臥,乳頭腫脹,外陰腫脹。產(chǎn)前5 d徹底不吃食物,哼叫,小幅走動(dòng),對(duì)外界聲光等敏感。臨產(chǎn)當(dāng)日煩躁、走動(dòng)加劇,產(chǎn)仔雙胎,孕期140 d。產(chǎn)后母獸溫順、安靜,母性良好。

2號(hào)大熊貓,9歲,體重89 kg,有繁育史,第1次人工授精前36 d出現(xiàn)輕微發(fā)情行為。至人工授精前3 d,出現(xiàn)按壓腰部后退翹尾、蹭陰、主動(dòng)接近種公獸等典型的發(fā)情行為,陰門外翻、色澤潮紅,試情接受爬跨。當(dāng)出現(xiàn)頻繁跑動(dòng)和排尿姿勢(shì),追逐種公獸,外陰色澤變淡時(shí),與種公獸合籠未完成交配,進(jìn)行人工授精。24 h內(nèi)分合適時(shí)間段再次進(jìn)行人工授精2次。在產(chǎn)前28 d出現(xiàn)輕微的行為變化,同樣有挑食現(xiàn)象。至產(chǎn)前11 d不吃竹子,乳房腫脹明顯,外陰未見(jiàn)明顯變化。產(chǎn)前5 d內(nèi)一直取吃水果,窩頭等食物,外陰有腫脹。臨產(chǎn)當(dāng)日表現(xiàn)驚恐,努責(zé)加劇,產(chǎn)仔單胎,孕期140 d。產(chǎn)后母獸溫順、安靜,母性良好。

1.1.2 樣品 自大熊貓出現(xiàn)輕微的發(fā)情行為開(kāi)始至產(chǎn)后10 d,收集每天上午9:00之前新鮮澄清尿液標(biāo)記、置-20℃冰箱保存待檢。

1.1.3 試劑 雌二醇/孕酮酶聯(lián)免疫法定量試劑盒,北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。

肌酐測(cè)定試劑盒,上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)分析儀,工作波長(zhǎng)400 nm～700 nm,測(cè)量范圍0.0～3.0A,線性誤差±1.25%～8.0%,重復(fù)性≤1.0%,穩(wěn)定性≤±0.005 A;電腦洗板機(jī),均勻性≤±5%,平均殘留量 2 μ L/孔。生化分析儀,工作波長(zhǎng)505 nm。

1.2 方法

1.2.1 激素測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)尿液中的雌二醇(E2)和孕酮(P4),羊抗兔包被成固相二抗,后加入待測(cè)尿液上清液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記雌二醇、孕酮以及抗雌二醇抗體,形成包被二抗-抗雌二醇、孕酮抗體-雌二醇(H RP)復(fù)合物,標(biāo)記雌二醇和孕酮的結(jié)合量與尿液中的雌二醇和孕酮量成反比。經(jīng)顯色后在酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,通過(guò)計(jì)算機(jī)擬合濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線,反算出待檢尿液中的雌二醇和孕酮含量。

1.2.2 肌酐測(cè)定 采用飽和苦味酸法測(cè)定。取新鮮尿液上清液用蒸餾水50倍稀釋,置 37℃水浴30 s后測(cè)定,結(jié)果乘以50。

1.2.3 尿液激素變化分析方法 為校正每份尿樣中水分含量變化帶來(lái)的差異,將每份尿樣中激素濃度除以肌酐濃度,換算成激素濃度與每毫克肌酐的比值作為尿液中激素計(jì)量單位[4],即ng/mg Cr。利用Excel繪制每只大熊貓整個(gè)繁育期的激素變化趨勢(shì)圖進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果

通過(guò)測(cè)定1號(hào)、2號(hào)兩只大熊貓3～9月份之間尿中雌二醇、孕酮,發(fā)現(xiàn)在發(fā)情期和妊娠期中,雌二醇、孕酮的變化呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性(圖1和圖2)。

為便于分析,選擇2只大熊貓?jiān)诎l(fā)情期中的首次人工授精當(dāng)日和圍產(chǎn)期中的生產(chǎn)當(dāng)天為0起點(diǎn)對(duì)尿中雌二醇、孕酮的變化進(jìn)行表述。

2.1 大熊貓發(fā)情期雌二醇、孕酮變化

1號(hào)大熊貓雌二醇基礎(chǔ)值為13.56±8.63 ng/mg Cr,第1次人工授精前7 d雌二醇值開(kāi)始有顯著上升(30.96 ng/mgCr)。至配種前1 d雌二醇值上升到最高 125.82 ng/mgCr,孕酮值為 9.18 ng/mg Cr,當(dāng)天進(jìn)行人工授精。其后雌二醇水平值逐漸降低,至第 9天與基礎(chǔ)值接近(13.85 ng/mgCr)。

該大熊貓?jiān)型A(chǔ)值為3.57 g/mg Cr±3.41 ng/mg Cr,配種后第3天開(kāi)始有上升趨勢(shì)(13.73 ng/mgCr),至第 9天變化較大(27.54 ng/mg Cr)。其后又有下降趨勢(shì),但較基礎(chǔ)值稍高。

2號(hào)大熊貓雌二醇基礎(chǔ)值為12.13 g/mg Cr±9.72 ng/mg Cr,第1次人工授精前至前3 d雌二醇值開(kāi)始有顯著上升(30.69 ng/mg Cr)。當(dāng)雌二醇值上升到最高88.69 ng/mg Cr,孕酮值為5.74 ng/mg Cr后,進(jìn)行人工授精。24 h內(nèi)分合適時(shí)間段再次進(jìn)行人工授精2次,其后雌二醇值逐漸降低。

該大熊貓?jiān)型A(chǔ)期值為3.84 ng/mg Cr±5.66 ng/mg Cr,配種后 4 d未出現(xiàn)較大波動(dòng),為48.74 ng/mg Cr。

圖1 1號(hào)大熊貓3月～8月份雌二醇、孕酮變化曲線Fig.1 Estradiol and progesterone curve of panda 1#from March to August

圖2 2號(hào)大熊貓4月～9月份雌二醇、孕酮變化曲線Fig.2 Estradiol and progesterone curve of panda 2#from April to September

2.2 大熊貓圍產(chǎn)期雌二醇、孕酮變化

1號(hào)大熊貓產(chǎn)前5 d孕酮值在33.01 ng/mg Cr～26.27 ng/mg Cr之間,雌二醇值為6.99 ng/mg Cr～15.10 ng/mg Cr之間。臨產(chǎn)雌二醇上升至達(dá)峰值27.75 ng/mg Cr,孕酮值下降至7.96 ng/mg Cr。產(chǎn)后雌二醇出現(xiàn)上升趨勢(shì),孕酮值比較平穩(wěn)。

2號(hào)大熊貓產(chǎn)前5 d內(nèi)孕酮值在11.02 ng/mg Cr～24.20 ng/mg Cr之間,雌二醇值為 39.63 ng/mg Cr～12.15 ng/mg Cr之間。臨產(chǎn)當(dāng)天雌二醇為19.62 ng/mg Cr,孕酮值最低為2.43 ng/mg Cr。產(chǎn)后雌二醇出現(xiàn)上升趨勢(shì),孕酮值趨于平穩(wěn)。

3 討論

3.1 發(fā)情期變化及配種時(shí)間的選擇

在發(fā)情前期持續(xù)時(shí)間上,1號(hào)大熊貓較長(zhǎng)為44 d,2號(hào)大熊貓為36 d,在此期間雌二醇變化幅度與基礎(chǔ)值相差不大,在11 ng/mg Cr～15 ng/mg Cr范圍之間。1號(hào)在配種前13 d,2號(hào)在配種前11 d雌二醇分別從基礎(chǔ)值開(kāi)始上升。這與喻述容[4]提出的尿中雌酮由基礎(chǔ)值上升達(dá)峰值需8 d～15 d比較一致。

2只大熊貓?jiān)诎l(fā)情期雌二醇的的峰值分別為125.82 ng/mg Cr、88.69ng/mg Cr。與其他研究結(jié)果,彭世媛[5](55.47 ng/mg Cr)、謝鐘(5.61 ng/mg Cr)等[6]差異較大,但接近楊勝林[7](68.2 ng/mg Cr～177.23 ng/mg Cr)的研究范圍。

關(guān)于尿中雌二醇濃度與雌獸行為相互關(guān)系的研究,Bonney R C[8]、曾國(guó)慶等[9]認(rèn)為,在發(fā)情高潮中,尿中雌二醇濃度迅速升高,在發(fā)情后期又逐漸下降到發(fā)情前水平。本次試驗(yàn)結(jié)果與Bonney等研究結(jié)果相一致。兩只大熊貓?jiān)诘竭_(dá)配種前3 d～7 d內(nèi)的雌二醇值突然上升。1號(hào)在7 d內(nèi)由30.96 ng/mg Cr上升至峰值 125.82 ng/mgCr,發(fā)情持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),進(jìn)度緩慢,在行為表現(xiàn)上相對(duì)不太強(qiáng)烈。而2號(hào)在3 d內(nèi)由30.69 ng/mgCr上升至峰值88.69 ng/mgCr,發(fā)情高潮期主要表現(xiàn)在雌二醇值較高的3 d內(nèi),行為典型,反映強(qiáng)烈,可以配合實(shí)施非麻醉狀態(tài)下的人工授精操作。

在首次人工授精時(shí),兩只大熊貓最為典型且一致的特點(diǎn)是兩者的外陰顏色由潮紅變?yōu)榉奂t色,黏液分泌物開(kāi)始減少,此時(shí)距雌二醇到達(dá)峰值至少為3 h(激素檢測(cè)所需時(shí)間)。因此,根據(jù)外陰顏色和分泌物減少的現(xiàn)象及人工授精與雌二醇峰值的時(shí)間差說(shuō)明人工授精時(shí)雌二醇含量已經(jīng)從峰值降低。從2只大熊貓當(dāng)年產(chǎn)仔的實(shí)例可以推測(cè),最佳人工授精時(shí)機(jī)應(yīng)在雌二醇值達(dá)到峰值后的24 h內(nèi)。彭世媛[5]、謝鐘[6]、曾國(guó)慶等[9]也認(rèn)為最佳配種時(shí)間是在發(fā)情高潮期的當(dāng)天和次日。

3.2 配種后孕酮變化

1號(hào)大熊貓配種后第7天孕酮開(kāi)始升高27.54 ng/mg Cr,48 d為64.88 ng/mg Cr,79d達(dá)最高峰223.64 ng/mg Cr,產(chǎn)前11d從 113.65 ng/mg Cr開(kāi)始突然下降,在產(chǎn)前5 d孕酮值為33.01 ng/mg Cr開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降,當(dāng)孕酮值下降至谷底當(dāng)日或次日生產(chǎn),產(chǎn)后孕酮值趨于基礎(chǔ)值。

2號(hào)大熊貓配種后第7天孕酮開(kāi)始上升為48.78 ng/mg Cr,64 d為74.08 ng/mg Cr,118 d為峰值622.70 ng/mgCr,產(chǎn)前 11 d從 70.54 ng/mg Cr開(kāi)始突然下降,在產(chǎn)前5d內(nèi)孕酮值為39.63 ng/mg Cr開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降,當(dāng)孕酮值下降至谷底當(dāng)天或次日生產(chǎn),產(chǎn)后孕酮值趨于基礎(chǔ)值。

兩者的孕酮分別在配種后 48 d、64 d上升到60 ng/mg Cr以上并在此水平之上維持81 d、65 d。在此期間,孕酮維持在較高水平,可能是胚胎較快發(fā)育并大量分泌孕酮的結(jié)果。妊娠期間孕酮變化趨勢(shì)也反映了胚胎發(fā)育停滯、迅速發(fā)育和臨產(chǎn)3個(gè)階段,與彭世媛等[5]的研究結(jié)果相吻合。

本試驗(yàn)中,2只大熊貓?jiān)诎l(fā)情期雌二醇值達(dá)到峰值后的24 h內(nèi)對(duì)其進(jìn)行人工授精受孕成功的幾率較大。雌二醇含量的改變與發(fā)情行為的變化存在一致性;產(chǎn)前孕酮值在峰值后開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降,當(dāng)孕酮值下降至谷底當(dāng)天或次日生產(chǎn)。

受大熊貓數(shù)量、年齡、體重、生理狀況及試驗(yàn)方法等多因素的影響,因此試驗(yàn)結(jié)果僅供參考,還有待進(jìn)一步擴(kuò)大數(shù)量進(jìn)行研究。

[1]趙學(xué)敏.大熊貓-人類共有的自然遺產(chǎn)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2006,8:167

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Variation of Estradiol and Progesterone Levels in Urine of Female Giant Pandas During the Breeding Season

ZHAO Peng-peng1,2,ZHANG Qiang2,SHEN Jie-na2,XU Guang-lan2,HOU Jia2,MA Qing-yi2,JIA Kang-sheng2,JIN Xue-lin2,JING Ya-ping1

(1.College of Veterinay Medicine,Northwest A&F University,Y angling,Shaanxi,712100,China;2.Shaanxi Rare Wildli fe Rescue Breeding Research Center,Zhouzhi,Shaanxi,710402,China)

Estradiol and progesterone hormones in the urine of two female pandas during the estrous and perinatal period were detected and analyzed by using ELISA technology in Shaanxi Rare Wildlife Rescue Breeding Research Center.The results showed that the artificial insemination of giant pandas conceived a greater chance of success within 24 hours after the peak of estradiol,there was a consistency between estrous variation and estradiol variation;progesterone peak declineed sharply before delivery,when the progesterone dropped to the bottom,the delivery came in the same day or the next day.

giant panda;ELISA;estradiol;progesterone

S865.31

A

1007-5038(2011)07-0045-04

2010-11-22

趙鵬鵬(1979-),男,寧夏隆德人,獸醫(yī)師,獸醫(yī)碩士生,主要從事大熊貓繁育研究。