豬巨細(xì)胞病毒PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用*

劉紅亮,朱 玲,徐志文,王燕群,魏浩澈,郭萬(wàn)柱,趙 玲

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心 動(dòng)物疫病與人類健康實(shí)驗(yàn)室,四川農(nóng)業(yè)大學(xué),四川雅安 625014)

豬巨細(xì)胞病毒PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用*

劉紅亮,朱 玲*,徐志文,王燕群,魏浩澈,郭萬(wàn)柱,趙 玲

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心 動(dòng)物疫病與人類健康實(shí)驗(yàn)室,四川農(nóng)業(yè)大學(xué),四川雅安 625014)

參考GenBank中收錄的豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)DNA聚合酶基因序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物,擴(kuò)增目的片段為236 bp。進(jìn)行PCR檢測(cè)方法的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn),建立了PCMV的PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明,該方法對(duì)模板的最低檢測(cè)量為1.1 pg,具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。應(yīng)用該法對(duì)豬同時(shí)感染PCMV和PRRSV相關(guān)性進(jìn)行初步探究,36份PRRSV陽(yáng)性病料中,PCMV檢出率為63.89%。該法可用于PCMV的臨床發(fā)病診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等。

豬巨細(xì)胞病毒;DNA聚合酶;PCR

豬巨細(xì)胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV),屬β皰疹病毒亞科。1955年Done J T[1]在豬鼻甲骨黏膜黏液腺巨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有大量嗜堿性核內(nèi)包涵體,并首次從英格蘭分離獲得皰疹樣病毒粒子。這是繼偽狂犬病病毒之后發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)豬皰疹病毒。因性質(zhì)及其所致病變與人巨細(xì)胞病毒和豚鼠唾液腺病毒相似,而感染動(dòng)物僅限于豬,故將該病毒稱為豬巨細(xì)胞病毒[2]。該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布,據(jù) Edington N[3]報(bào)道,早在 1986年,英國(guó)已有90%的豬群感染此病毒,其中大部分發(fā)生在管理良好、健康水平較高的農(nóng)場(chǎng)。日本于1981年6月～11月,對(duì)45個(gè)都道府縣的441例肉豬血清用間接熒光抗體法做了抗體調(diào)查,其中434例(98.4%)為陽(yáng)性;1985年首次在日本分離到該病毒[4]。韓國(guó)[5]、北美和澳大利亞也有報(bào)道,其中美國(guó)發(fā)病率甚高,豬群的抗體陽(yáng)性率為90%。

國(guó)內(nèi)關(guān)于豬巨細(xì)胞病毒PCR檢測(cè)的報(bào)道甚少,對(duì)豬巨細(xì)胞病毒病的調(diào)查報(bào)道亦少,近年來僅見廣西有此病毒感染的初步調(diào)查[6]。本研究建立了豬巨細(xì)胞病毒的PCR檢測(cè)方法,并用此法對(duì)四川省部分地區(qū)(遂寧、樂山、眉山、簡(jiǎn)陽(yáng)、雅安和德陽(yáng))采集樣品進(jìn)行檢測(cè),對(duì)本病毒在這些地區(qū)的流行情況進(jìn)行了初步的調(diào)查,為今后該病毒感染的診斷和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料 PCV-2、PPV 、PRV 、PRRSV均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心分離保存。方法建立所用PCMV陽(yáng)性病料由實(shí)驗(yàn)室保存;36份檢測(cè)樣品為2009年1月～9月采集自四川部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng),經(jīng)PRRSV檢測(cè)為陽(yáng)性的病料(肺、淋巴結(jié))。

1.1.2 主要試劑 克隆宿主菌E.coliDH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心提供;DNA抽提試劑盒(小量)、膠回收試劑盒均購(gòu)于博邁德公司;TaqDNA 聚合酶 、dNTP、10 ×Reaction buffer、MgCl2、pMD19-T載體均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布PCMV基因序列(登錄號(hào)AF268040),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCMV1/PCMV 2:上游引物PCMV 1:5′-CCTATGT TGGCACT GATACT TGAC-3′;下 游 引 物 PCMV2:5′-CCCTGAAAATCACCGTCTGAGAGA-3′,預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)236 bp。通過計(jì)算機(jī)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BL-A ST/)分析,該對(duì)引物具有良好的特異性。引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 病料處理 取解凍的待檢病料3 g,用滅菌的手術(shù)剪剪碎,加入適量的生理鹽水或PBS溶液(pH7.2)混勻,用滅菌研磨器充分研磨,再用1.5 mL Eppedorf管分裝,反復(fù)凍融2次～3次,置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒DNA模板的制備 取病毒液和病料混懸液參照博邁德DNA小劑量抽提試劑盒說明書進(jìn)行病毒DNA的提取。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)反復(fù)篩選,最佳PCR 擴(kuò)增體系為10×PCR buffer 2.5 μ L、dNTP(5 mmol/L)1 μ L 、上下游引物(20 μ mol/L)各0.5 μ L 、TaqDNA 聚合酶(5 U)0.5 μ L 、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μ L 、模板 DNA 2 μ L,最后用無菌ddH2O補(bǔ)足至25 μ L(陰性對(duì)照不加模板,直接加無菌ddH2O補(bǔ)足至25 μ L)。最佳PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 min,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,產(chǎn)物4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收目的片段,與pMD 19-T載體連接、轉(zhuǎn)化 DH5α菌、擴(kuò)大培養(yǎng)、提質(zhì)粒,送上海Invitrogen公司測(cè)序,結(jié)果在NCBI上BLAST比對(duì)。

1.2.5 PCR特異性試驗(yàn) 按1.2.3所述方法提取PCV2、PPV 、PRV 、PRRSV 基因組做模板,按 1.2.4體系及方法進(jìn)行擴(kuò)增,以驗(yàn)證本方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將提取的病毒核酸測(cè)定濃度后,用雙蒸水做10倍系列稀釋,取每個(gè)稀釋度的病毒模板按1.2.4體系及方法進(jìn)行PCR反應(yīng),以驗(yàn)證本方法的敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 以建立的PCR方法,對(duì)同一模板重復(fù)檢測(cè)3次,以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品的檢測(cè) 利用本方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集的四川不同地區(qū),PRRSV檢測(cè)為陽(yáng)性的36份病料進(jìn)行應(yīng)用性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及鑒定

用引物PCMV1、PCMV2對(duì)模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增,在10 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,擴(kuò)增出的DNA約為236 bp(圖1),陰性對(duì)照無條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。將與載體相連的陽(yáng)性質(zhì)粒送上海Invitrogen公司測(cè)序,進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明所得到的片段與GenBank收錄的PCMV相應(yīng)區(qū)域相似性達(dá)100%。

2.2 特異性試驗(yàn)

對(duì)PCMV模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)了約236 bp的目的條帶,而 PCV-2、PPV 、PRV 、PRRSV及陰性對(duì)照全為陰性(圖2)。

圖1 PCM V PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig.1 PCR Amplification of PCMV

圖2 PCR特異性試驗(yàn) Fig.2 Specificity test of PCR

2.3 PCR敏感性試驗(yàn)

將測(cè)定濃度后的病毒模板進(jìn)行10倍倍比稀釋,在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示在稀釋至10-5,仍有陽(yáng)性條帶可見,即在此PCR反應(yīng)中,模板的最低檢測(cè)量為1.1 pg(圖3)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一陽(yáng)性模板進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè),獲得了一致的檢測(cè)結(jié)果(圖4)。

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

用此方法對(duì)36份采自四川不同地區(qū)PRRSV陽(yáng)性的病料進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果檢出23份PCMV陽(yáng)性,檢出率達(dá)63.89%。

圖3 PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of PCR

圖4 PCR重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4 Repeatability test of PCR

3 討論

PCMV雖然在免疫功能正常的宿主中一般呈隱性感染,并不引起臨床癥狀,但其感染率很高,當(dāng)病毒被激活時(shí),可能與一些疾病相關(guān)。近年來,國(guó)外關(guān)于PCMV的報(bào)道主要集中在其對(duì)異種移植的影響方面,有研究發(fā)現(xiàn)β皰疹病毒包括HHV-6、HHV-7及CMV能夠在器官移植后引起器官移植受者產(chǎn)生機(jī)會(huì)感染,由此產(chǎn)生一系列癥狀和疾病,統(tǒng)稱為CMV疾病(CMV disease)。同為皰疹病毒科的PCMV亦為異種移植中潛在的動(dòng)物傳染源。臨床上廣泛采用免疫抑制劑以克服器官移植引起的排斥反應(yīng),但免疫抑制劑的使用使機(jī)體免疫功能尤其是細(xì)胞免疫功能受損,從而引發(fā)各種術(shù)后感染。有人擔(dān)心豬源病毒可能會(huì)隨著移植器官傳播[7-9]。雖然傳播給人類并沒有在體內(nèi)證明,豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒已被證明在體外能在人類細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制[10-11],并且已有試驗(yàn)表明PCMV在體外能在人成纖維細(xì)胞中增殖[12]。鑒于PCMV在豬體內(nèi)的高陽(yáng)性率,對(duì)于人類,PCMV可能代表另一種潛在風(fēng)險(xiǎn)。

PCMV在體外增殖有一定難度,所以用病毒分離的方法檢測(cè)較困難。此病的ELISA檢測(cè)方法,在20世紀(jì)80年代已有報(bào)道[13-14],但是現(xiàn)有的 ELISA檢測(cè)方法只能檢測(cè)相關(guān)抗體,無法檢測(cè)抗原。Hamel A L等[15]首次報(bào)道了應(yīng)用PCR診斷本病,之后,Fryer J F L等[16]用定量競(jìng)爭(zhēng) PCR對(duì)不同的豬器官(包括用于異種移植供體)進(jìn)行了病毒的檢測(cè)。亦有對(duì)PCV、PRV和PCMV進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的報(bào)道,并指出多重PCR檢測(cè)的靈敏性較低,僅為單個(gè)PCR的十分之一[5]。上述方法應(yīng)用于臨床快速檢測(cè)存在對(duì)設(shè)備要求較高,費(fèi)用消耗較大,耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。NCBI上已公布PCMV相關(guān)基因信息較少,主要為gB、MCP和DNA聚合酶基因。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)[17]和廣西大學(xué)[6]已有報(bào)道通過擴(kuò)增部分gB基因建立PCR檢測(cè)方法;目前GenBank上只公布有一個(gè)MCP基因,其保守性無法分析;而國(guó)內(nèi)以DNA聚合酶為模板設(shè)計(jì)引物建立的檢測(cè)方法僅見劉興彩等[18]報(bào)道,通過MegAlign軟件對(duì)已公布的PCMV DNA聚合酶進(jìn)行序列分析,其相似性高達(dá)99%以上,說明此區(qū)適合用于檢測(cè)。鑒于以上原因本研究選擇DNA聚合酶保守區(qū)作為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物,通過計(jì)算機(jī)在線分析,該對(duì)引物具有良好的特異性。經(jīng)試驗(yàn)證明該檢測(cè)方法能有效用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查,具有簡(jiǎn)單、快速、敏感等特點(diǎn)。

近年來豬高熱病的盛行,引發(fā)了人們對(duì)高熱病的新思考,感染高致病性PRRSV是高熱病的主要發(fā)病原因。有人認(rèn)為豬感染PRRSV與感染PCMV具有很大的相關(guān)性。在本研究中,用建立的PCMV PCR檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室近期保存的PRRSV陽(yáng)性病料進(jìn)行了檢測(cè),分析PRRSV和PCMV同時(shí)感染的概率,以初步考證這一說法。結(jié)果表明,在PRRSV陽(yáng)性病料中PCMV陽(yáng)性率高達(dá)63.89%(23/36),分析原因可能是PRRSV侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng),動(dòng)物機(jī)體感染PRRSV后,抵抗力降低,易并發(fā)和繼發(fā)其他病原體感染。亦有研究者根據(jù)病毒能持續(xù)感染肺泡巨噬細(xì)胞這一事實(shí),推測(cè)該病毒可能具有免疫抑制作用[10]。但由于樣品數(shù)量的局限性,該病在全地區(qū)的具體流行、分布情況及其與PRRSV感染的關(guān)系尚需進(jìn)一步做大量的研究工作才能夠得出科學(xué)客觀的結(jié)果。

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Development and Application of a PCR Assay for Detection of Porcine Cytomegalovirus

LIU Hong-liang,ZHU Ling,XU Zhi-wen,WANG Yan-qun,WEI Hao-che,GUO Wan-zhu,ZHAO Ling

(Animal Biotechnology Center,Laboratory of Animal Disease and Human Health,Sichuan Agricultural University,Ya'an,Sichuan,625014,China)

A pair of primers were designed according to the DNA polymerase(DPOL)genes of porcine cytomegalovirus(PCMV)to develop a PCR assay for detection of PCMV,the length of the product is 236 bp.The specificity,sensitivity and repeatability of the PCR assay were conducted,the results indicated that the necessary dose of templates of the assay is 1.1pg and this method is sensitive,specific and repeatable.The positive rate of the 36 clinical samples,which are PRRSV positive,detected according to the method,was 63.89%of PCMV.This method is available to detect PCMV in clinic and epidemiological monitoring.

Porcine cytomegalovirus;DNA polymerase;PCR

S852.659.1;Q789

A

1007-5038(2011)07-0005-04

2010-12-17

“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT0848);四川省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目

劉紅亮(1987-),男,四川安岳人,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)2008級(jí)2班本科學(xué)生。*通訊作者

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