甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表達(dá)及用于膠體金檢測方法的研究

王云龍,郭文麗,孫新城,李玉林,李恒思,陳冬煥,王 真,董彩文,劉旺根

(1.河南師范大學(xué),河南新鄉(xiāng) 453007;2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450121;3.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450001;4.鄭州大學(xué),河南鄭州 450001)

甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表達(dá)及用于膠體金檢測方法的研究

王云龍1,2,郭文麗1,孫新城4,李玉林3,李恒思3,陳冬煥3,王 真3,董彩文3,劉旺根3

(1.河南師范大學(xué),河南新鄉(xiāng) 453007;2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450121;3.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450001;4.鄭州大學(xué),河南鄭州 450001)

根據(jù)GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全長基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30 Xa/LIC-HA。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。對表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測的結(jié)果表明,HA基因獲得表達(dá),產(chǎn)物具有免疫學(xué)活性,分子質(zhì)量約64 ku,以包涵體形式存在。以純化的重組蛋白作為抗原初步建立了雙抗原夾心檢測甲型H1N1流感HA抗體的膠體金方法。該方法能檢測出甲型H1N1流感陽性血清,為疫苗效果的評價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

甲型H1N1流感病毒;血凝素;原核表達(dá);膠體金

2009年3月首先在墨西哥和美國出現(xiàn)的甲型H1N1流感,通過人群傳播,在短時(shí)間內(nèi)迅速蔓延至全球,造成了極大的危害[1-2]。目前市面上暫無針對甲型H1N1流感的特效藥,其預(yù)防仍以接種疫苗為主。疫苗通過其主要成分血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,抵抗流感病毒感染[3-4]。但疫苗接種后,是否能誘發(fā)被接種者產(chǎn)生抗體,并沒有可靠的快速檢測方法。國內(nèi)外對甲型流感抗體ELISA的研究較早,而膠體金檢測法與ELISA法相比具有速度快,不需設(shè)備,適合現(xiàn)場檢查的特點(diǎn)。本研究的目的是建立甲型H1N1流感病毒HA抗體的膠體金檢測方法,用以檢測被接種者血清中是否存在HA抗體,為疫苗的效果評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c純系小鼠,由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)、pET-30 Xa/LIC 載體,由河南省生物工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.3 主要試劑NdeⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶、T4 DNA ligase,購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA膠回收試劑盒購自Axygen;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG),PEG20000,購自Sigma公司;甲型H1N1流感病毒裂解疫苗,購自華蘭生物工程股份有限公司;氯金酸,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;檸檬酸三鈉,購自天津化學(xué)試劑三廠;硝酸纖維素膜(NC膜),購自德國Sartorius;PVC底板、玻璃纖維膜、吸水紙,購自上海金標(biāo)生物科技有限公司;未接種甲型H1N1流感疫苗的人血清、接種甲型H1N1流感疫苗的人血清、羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體,由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。甲型H1N1抗體檢測酶聯(lián)免疫試劑盒,購自武漢華美生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的人工合成 根據(jù)GenBank收錄的甲型 H1N1流感病毒的相關(guān)序列(登錄號GQ122097),選取其中的血凝素全長基因,并在兩端分別加上XhoⅠ、NdeⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NdeⅠ分別酶切合成的 HA片段與質(zhì)粒pET-30 Xa/LIC,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,切取目的片段,按DNA膠回收試劑盒說明操作。前者回收HA片段,后者回收線性化的載體片段。T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在 LB(卡那霉素 30 mg/L)平板上,37℃培養(yǎng)過夜。篩選陽性菌落,擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒。經(jīng)XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的質(zhì)粒命名為 pET-30 Xa/LIC-HA,轉(zhuǎn)入表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)中,擴(kuò)大培養(yǎng),并設(shè)立對照。37℃、200 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時(shí),誘導(dǎo)樣加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L),37℃下誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)結(jié)束后,離心收集菌體,用0.02 mol/L pH 7.8 PB重懸,超聲破碎菌體后12 000 r/min,離心10 min,分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 Western blot檢測表達(dá)產(chǎn)物免疫活性 首先對血清進(jìn)行吸附。將培養(yǎng)過夜的菌液離心,收集菌體,超聲波破碎。用破碎后的菌液吸附甲型H1N1陽性血清中HA抗體。將菌液與血清按1∶5混合,37℃作用45 min,在4 ℃以 10 000 r/min離心10 min,取上清備用[5]。參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行Western blot。

1.2.5 目的蛋白的純化 取陽性菌株大量發(fā)酵,誘導(dǎo)條件同上。破菌后,5 000 r/min離心15 min,棄上清,用1%TritonX-100洗滌沉淀。5 000 r/min離心15 min,棄上清,8 mol/L尿素溶解沉淀,過鎳親和層析柱。依次用含20、50、100、200 mmol/L咪唑的8 mol/L尿素梯度洗脫,SDS-PAGE電泳檢測洗脫液。

1.2.6 膠體金檢測方法的建立 ①膠體金顆粒的制備:本研究使用的膠體金顆粒是采用檸檬酸三鈉法參照文獻(xiàn)[7]制備的。②金標(biāo)抗原的制備:向1.0 mL膠體金溶液中加入10 g/L K2CO3至最佳pH,混勻后,緩慢加入適量重組蛋白,充分混勻,穩(wěn)定50 min后,加入 20 g/L PEG20000、小牛血清各10 μ L,靜置10 min。將標(biāo)記好的膠體金抗原復(fù)合物10 000 r/min離心15 min,棄上清,加膠體金緩沖液500 μ L 懸起;10 000 r/min 離心 10 min,棄上清 ,加膠體金緩沖液 100 μ L懸起,備用。③包被:將兔抗HA和重組蛋白分別標(biāo)記在NC膜上的C線(質(zhì)控線)和 T線(檢測線)處。④檢測方法:檢測時(shí),將試紙條平放,加金標(biāo)復(fù)合物 10 μ L至玻璃棉上,待滲入;加待測血清30 μ L于樣品墊上。10 min后判斷結(jié)果。⑤結(jié)果判定:NC膜上出現(xiàn)兩條紅色條帶為陽性;僅質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶為陰性;僅檢測線出現(xiàn)一條紅色條帶顯示該試紙條無效。30 min后,判讀結(jié)果無效。

2 結(jié)果

2.1 HA基因的人工合成

人工合成的HA全長經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析表明,合成的基因約為1 700 bp,與預(yù)期相符(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將合成的HA全長基因與載體pET-30 Xa/LIC經(jīng)XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切后連接,轉(zhuǎn)化DH5α。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定獲得1 700 bp和5.4 kb左右的兩個(gè)條帶,與預(yù)期相符。測序結(jié)果正確(圖2)。

圖1 合成的HA基因電泳圖Fig.1 Electrophoresis of sy nthetic HA gene

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將BL21(DE3)/pET-30 Xa/LIC-HA在37℃,0.1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE顯示在包涵體中有64 ku左右目的蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒pET-30 Xa/LIC-HA誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expressed protein of pET-30 Xa/LIC-HA

2.4 Western blot檢測結(jié)果

誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Western blot結(jié)果顯示,該蛋白能與甲型H1N1陽性血清發(fā)生特異反應(yīng),具有抗原性(圖4)。

圖4 重組質(zhì)粒pET-30 Xa/LIC-HA表達(dá)產(chǎn)物的Western blot檢測Fig.4 Western blot of the expressed protein of pET-30 Xa/LIC-HA

2.5 膠體金試紙條檢測結(jié)果

用制備好的膠體金試紙條檢測20份未接種甲型H1N1流感疫苗的人血清和20份接種甲型H1N1流感疫苗14 d后的人血清,同時(shí)以武漢華美生物有限公司生產(chǎn)的甲型H1N1抗體檢測酶聯(lián)免疫試劑盒作為對照試劑。結(jié)果顯示,檢測未接種甲型H1N1流感疫苗的人血清時(shí)僅質(zhì)控線顯色,為陰性結(jié)果;檢測疫苗接種14 d后的人血清時(shí),兩條線顯色均較明顯,為陽性結(jié)果(表 1)。膠體金試紙條的檢測結(jié)果與對照試劑的檢測結(jié)果一致。說明此檢測方法能較準(zhǔn)確、快速地檢測出疫苗免疫者血清中的HA抗體。

表1 試紙條的檢測結(jié)果Table 1 T he test results of strips

3 討論

流感病毒是引起流行性感冒的病原體。由于它可以通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變逃避免疫監(jiān)視,故對人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[8]。血凝素(HA)位于病毒顆粒表面,是構(gòu)成病毒包膜纖突的主要成分之一,具有凝集紅細(xì)胞的能力。它是流感病毒最主要的保護(hù)性抗原,可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫,誘導(dǎo)主要的保護(hù)性中和抗體產(chǎn)生。同時(shí),HA具有較強(qiáng)的免疫原性。因此,它被認(rèn)為是流感疫苗研究的首選抗原[9]。

流感疫苗是人們在流感流行和大流行期間預(yù)防染病的最有效方法之一。但疫苗接種后,接種者體內(nèi)保護(hù)性抗體(HA抗體)的產(chǎn)生情況與接種者年齡、接種時(shí)間、個(gè)人免疫狀況、疫苗株與流行株匹配情況等多方面有密切關(guān)系[10]。因此,盡管甲型流感疫苗已研制成功,然而對疫苗保護(hù)效果的評價(jià)依然采用血凝抑制試驗(yàn),只能在具有一定生物安全等級的研究機(jī)構(gòu)才能開展,限制了其推廣應(yīng)用[11]。

膠體金標(biāo)記技術(shù)是繼熒光素、酶、同位素三大標(biāo)記技術(shù)后的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。它以膠體金顆粒作為示蹤物或顯色劑,由于其具有快速、操作簡單、結(jié)果明確和無需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于體外診斷中[12-13]。

本試驗(yàn)以1 700 bp左右的HA全長基因作為目的片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30 Xa/LIC-HA,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),經(jīng)37℃,0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE鑒定,發(fā)現(xiàn)在64 ku處表達(dá)了一條特異的融合蛋白條帶,分子量與預(yù)期的甲型H1N1流感病毒HA蛋白大小相符。同時(shí),建立的雙抗原夾心法檢測HA抗體的膠體金方法,能檢測出甲型H1N1流感疫苗免疫陽性血清。下一步,我們將擴(kuò)大檢測樣本量,進(jìn)一步完善HA抗體檢測,為疫苗研制、免疫效果的評價(jià)及流行性學(xué)調(diào)查提供新的手段。

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Prokaryotic Expression of Hemagglutinin Gene of H1N1 Influenza A Virus and Its Preliminary Application in Colloidal Gold Immunochromatographic Assay

WANG Yun-long1,2,GUO Wen-li1,SUN Xin-cheng4,LI Yu-lin3,LI Heng-si3,CHEN Dong-huan3,WANG Zhen3,DONG Cai-wen3,LIU Wang-gen3

(1.Henan Normal University,Xinxiang,Henan,453007,China;2.Zhengzhou Technical College,Zhengzhou,Henan,450121,China;3.Henan Bioengineering Research Center,Zhengzhou,Henan,450001,China;4.Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan,450001,China)

According to the relevant nucleotide sequence from GenBank,the hemagglutinin(HA)gene of H1N1 influenza A virus was synthetized.The product was used for constructing a prokaryotic recombinant plasmid pET-30 Xa/LIC-HA.The constructed vector was transformed toE.coliBL21(DE3)for expression under the induction of IPTG.The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blot.The target protein in the form of inclusion bodies,with a relative molecular mass of about 6 400,showed immunogenicity.A GICA for detecting antibodies against HA of H1N1 influenza A has been preliminarily developed with double-antigen sandwich assay using purified HA protein as antigen.Positive sera against H1N1 influenza A detected by GICA showed positive reaction.The method provided a solid basis for further research of the appraisal of vaccines.

H1N1 influenza A virus;hemagglutinin;prokaryotic expression;GICA

S852.659.5;Q786

A

1007-5038(2011)07-0001-04

2010-12-11

河南省工程技術(shù)中心專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(102102313105);鄭州市重大科技專項(xiàng)計(jì)劃(093SGBS22027)

王云龍(1962-),男,河南洛陽人,教授,主要從事生物制藥研究。