林可霉素-大觀霉素復(fù)方混懸注射液中有效成分含量的HPLC法測(cè)定*

王 忠,王立琦,劉小琴,范惠敏,黃顯會(huì),曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

林可霉素-大觀霉素復(fù)方混懸注射液中有效成分含量的HPLC法測(cè)定*

王 忠,王立琦,劉小琴,范惠敏,黃顯會(huì),曾振靈*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

建立了測(cè)定林可霉素-大觀霉素復(fù)方油混懸注射液中鹽酸林可霉素與鹽酸大觀霉素含量的高效液相色譜(HPLC)方法。采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μ m),檢測(cè)林可霉素的流動(dòng)相為0.05 mol/L硼砂溶液(用850 mL/L磷酸調(diào)節(jié) pH 至5.0)-甲醇-乙腈(60∶36∶4),檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm;檢測(cè)大觀霉素的流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-水(30∶35∶35),檢測(cè)波長(zhǎng)為415 nm。結(jié)果表明,在 10 μg/mL～40μg/mL濃度范圍內(nèi),林可霉素和大觀霉素均呈良好線性關(guān)系,二者平均回收率分別為98.68%和99.10%,平均批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.93%和0.86%,批間變異系數(shù)分別為1.68%和0.98%。本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可用于林可霉素-大觀霉素復(fù)方油混懸注射液含量的測(cè)定。

林可霉素-大觀霉素復(fù)方油混懸注射液;鹽酸林可霉素;鹽酸大觀霉素;高效液相色譜法;含量測(cè)定

*通訊作者

林可霉素與大觀霉素合用為獸醫(yī)臨床常用復(fù)方,二者配伍有協(xié)同作用,對(duì)仔豬腹瀉、豬的支原體肺炎和雞慢性呼吸道病具有很好的療效[1]。其現(xiàn)有的復(fù)方劑型有預(yù)混劑與可溶性粉[2]。筆者研制的鹽酸林可霉素-鹽酸大觀霉素油混懸注射液振搖易分散,各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)符合藥劑學(xué)要求。中國(guó)獸藥典[3]與美國(guó)藥典[4]檢測(cè)林可霉素均采用高效液相色譜法(HPLC)。大觀霉素極性強(qiáng),無(wú)發(fā)色集團(tuán),紫外最大吸收波長(zhǎng)在190 nm附近,屬于末端吸收區(qū),含量分析較為困難[5]。目前,大觀霉素含量的測(cè)定有微生物法[4]、氣相色譜法[6-7]、薄層色譜法[8]、高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法(HPLC-ECD)[9-10]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)[11-12]、高效液相色譜熒光法[13]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15],這些方法或者缺乏特異性,或者對(duì)儀器要求較高,對(duì)于普通的藥物制劑含量的測(cè)定而言,成本較高或較復(fù)雜。本文采用HPLC法對(duì)林可霉素-大觀霉素復(fù)方混懸注射液中林可霉素和大觀霉素的含量進(jìn)行測(cè)定,較之微生物法和氣相色譜法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),為此復(fù)方藥物的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子分析天平,FA2004N型,為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;Dionex U-3000系列液相色譜儀;Dionex U-3000紫外檢測(cè)器,chromeleon色譜工作站,為美國(guó)Dionex公司產(chǎn)品。

1.1.2藥品 鹽酸林可霉素對(duì)照品,含量87.9%,批號(hào):k0100708;大觀霉素精制品,含量 99%,批號(hào):S9007,Sigma公司分裝。2,4-二硝基苯肼(DNPH)、三氟乙酸(TFA)為化學(xué)純,乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取鹽酸林可霉素對(duì)照品適量,加水定容,得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱(chēng)取大觀霉素精制品適量,加水定容,得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密量取林可霉素-大觀霉素復(fù)方混懸注射液1 mL,加入10 mL超純水,渦旋,振蕩,然后5 000 r/min離心10 min,林可霉素樣品取水相用超純水稀釋適當(dāng)倍數(shù),0.22 μ m濾膜過(guò)濾,進(jìn)行HLPC檢測(cè);大觀霉素樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后取0.15 mL進(jìn)行衍生化處理。

1.2.3 大觀霉素的衍生化 大觀霉素衍生化參照文獻(xiàn)[16-18]進(jìn)行。取0.15 mL待測(cè)大觀霉素樣品溶液于2 mL離心管中,加入0.6 mL TFA-乙腈溶液(以乙腈為溶劑,TFA為溶質(zhì),濃度為60 g/L)和0.6 mL DNPH-乙腈溶液(以乙腈為溶劑,DNPH為溶質(zhì),濃度為5 g/L),渦旋,置于70℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行衍生化反應(yīng)1 h,待完成后置于冰塊中,待冷卻后取出加入0.15 mL丙酮以終止反應(yīng),渦旋,然后繼續(xù)置于70℃恒溫水浴鍋中加熱10 min,取出自然冷卻,15 000 r/min離心10 min,過(guò)膜后進(jìn)行H LPC檢測(cè)。

1.2.4 色譜條件 色譜柱為HypersilBDS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm,5 μ m)。林可霉素流動(dòng)相為0.05 mol/L硼砂溶液(用850 mL/L磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0)-甲醇-乙腈(60∶36∶4),檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm,柱溫為室溫,流速 1 mL/min,進(jìn)樣量 20 μL[3];大觀霉素流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-水(30∶35∶35),檢測(cè)波長(zhǎng)為415 nm,柱溫為30℃,流速 1 mL/min,進(jìn)樣量 20 μL[16]。

1.2.5 雜質(zhì)干擾試驗(yàn) 取空白混懸劑(與林可霉素和大觀霉素復(fù)方混懸劑相比,僅不含林可霉素和大觀霉素,其余成分相同)適量,按照“1.2.2”與“1.2.3”的方法處理后,分別對(duì)林可霉素和大觀霉素進(jìn)行H LPC檢測(cè)。

1.2.6 線性關(guān)系考察 取鹽酸林可霉素儲(chǔ)備液,加水稀釋得到 10 、15、20、25 、30、35、40 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液,過(guò)0.22 μ m濾膜后進(jìn)行H LPC檢測(cè)。另現(xiàn)配大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)液,加水稀釋得到 100、150、200、250、300 、350 、400 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工 作液,按“1.2.3 ”處理后終濃度分別為 10、15、20、25、30、35、40 μg/mL,進(jìn)行HLPC檢測(cè)。分別將林可霉素和大觀霉素色譜峰面積與相應(yīng)的藥物濃度作線性回歸。

1.2.7 回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取大觀霉素原料藥兩組,置于錐形瓶中,一組加入空白輔料,另一組加水溶解。分別稀釋得到高、中、低三個(gè)添加濃度的混懸劑樣品和原料藥溶液?；鞈覄悠钒凑铡?.2.2”與“1.2.3”方法處理后,分別對(duì)林可霉素和大觀霉素進(jìn)行HLPC檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4次,按公式計(jì)算不同添加濃度的回收率。回收率=(混懸劑濃度/原料藥水溶液濃度)×100%。

1.2.8 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確取林可霉素-大觀霉素復(fù)方混懸劑樣品適量,每批4份,共4批,按照“1.2.2”與“1.2.3”處理后,對(duì)林可霉素和大觀霉素進(jìn)行H LPC檢測(cè)。分別計(jì)算林可霉素和大觀霉素的批內(nèi)及批間變異系數(shù)。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大觀霉素同一樣品與林可霉素同一樣品,分別于 0、3、6、9、12 h 測(cè)定 ,以峰面積計(jì)算大觀霉素和林可霉素(n=5)的RSD。

1.2.10 樣品含量測(cè)定 根據(jù)樣品的配制與處理方法,分別檢測(cè)5批自制林可霉素-大觀霉素復(fù)方混懸劑中林可霉素和大觀霉素的含量。

2 結(jié)果

2.1 雜質(zhì)干擾試驗(yàn)

由圖1可知,輔料對(duì)鹽酸林可霉素和鹽酸大觀霉素含量的測(cè)定均無(wú)影響,且鹽酸林可霉素與鹽酸大觀霉素亦相互無(wú)影響。

圖1 HLPC檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of HLPC

2.2 線性關(guān)系考察

在 10 μg/mL/ ～ 40 μg/mL 范圍內(nèi),二者的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系,大觀霉素回歸方程為:y=1.043 2x+0.817 1,r=0.999 9,n=7;林可霉素回歸方程為:y=13.493x-1.987 5,r=1,n=7。

2.3 回收率試驗(yàn)

在濃度10、25、40 μg/mL/時(shí)混懸劑中大觀霉素回收率分別為99.07%、99.29%和98.94%,平均回收率為99.10%;林可霉素在相應(yīng)濃度的回收率分別為99.05%、98.61%和 98.54%,平均回收率為98.68%。

2.4 精密度試驗(yàn)

添加濃度均為25 μg/mL,測(cè)得的混懸劑中林可霉素與大觀霉素的變異系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)大觀霉素同一樣品與林可霉素同一樣品 ,在 0、3 、6、9、12 h 測(cè)定,以峰面積計(jì)算大觀霉素和林可霉素(n=5)的RSD分別為0.52%和0.49%。表明供試樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品含量測(cè)定

混懸劑中林可霉素平均含量為5%,大觀霉素平均含量為10%(表2)。

表1 混懸劑中林可霉素與大觀霉素的變異系數(shù)Table 1 T he coefficients of variation of lincomycin and spectinomycin in oily suspensions

表2 林可霉素-大觀霉素混懸劑的含量Table 2 T he contents of lincomy cin and spectinomycin in oily suspensions

3 討論

3.1 林可霉素檢測(cè)方法的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道林可霉素HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)有204

nm[19]、208 nm[20]、210 nm[4]、214 nm[21],本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同濃度的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在190 nm～400 nm區(qū)間進(jìn)行紫外光譜掃描,結(jié)果表明:不同濃度林可霉素標(biāo)準(zhǔn)液的特征吸收峰不同,這與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的林可霉素紫外光譜無(wú)特異吸收相同,但與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的211 nm有所不同。美國(guó)藥典(27版)[4]林可霉素檢測(cè)色譜條件為:C8柱,以磷酸溶液-甲醇-乙腈(780∶150∶150)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。朱義舟[24]通過(guò)對(duì)中國(guó)藥典(2005版)和美國(guó)藥典(27版)中HPLC法測(cè)定鹽酸林可霉素含量方法的比較發(fā)現(xiàn),從線性范圍、回收率、檢測(cè)限、定量限以及峰面積等指標(biāo)來(lái)看,中美兩國(guó)藥典盡管色譜條件不同,但測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異。但美國(guó)藥典要求的條件較苛刻,而中國(guó)藥典條件較寬松。所以本試驗(yàn)采用中國(guó)獸藥典(2005版)(中國(guó)藥典與中國(guó)獸藥典中林可霉素檢測(cè)方法相同)林可霉素檢測(cè)方法檢測(cè)林可霉素的含量,且取得了較好的檢測(cè)結(jié)果。

3.2 大觀霉素檢測(cè)方法的選擇

3.2.1 衍生化 衍生化試劑DNPH與大觀霉素的羰基反應(yīng)生成苯腙化合物DNPH-大觀霉素[17],反應(yīng)需在酸性條件下進(jìn)行,三氟乙酸(TFA)用于控制反應(yīng)過(guò)程中酸性條件[18]。文獻(xiàn)報(bào)道 TFA-乙腈溶液的濃度有3%[25]和6%[17],本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)濃度為3%和6%TFA-乙腈溶液進(jìn)行比較,濃度為6%的 TFA-乙腈溶液作為酸性條件控制溶液所得出大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好,所以本試驗(yàn)的大觀霉素衍生化反應(yīng)采用6%TFA作為大觀霉素衍生化反應(yīng)酸性條件的控制溶液。

3.2.2 流動(dòng)相比例 大觀霉素檢測(cè)中采用的色譜分離方法有梯度洗脫法[18]和等度洗脫法[16],文獻(xiàn)[18]報(bào)道的梯度洗脫法需采用混合流動(dòng)相,較為復(fù)雜。本試驗(yàn)參考Yan H D等[16]的方法中,大觀霉素檢測(cè)的流動(dòng)相比例對(duì)不同濃度DNPH-大觀霉素進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)大觀霉素藥物峰與一小的雜質(zhì)峰分離較差,檢測(cè)低濃度DNPH-大觀霉素時(shí)可見(jiàn)該雜質(zhì)峰,而在檢測(cè)較高濃度DNPH-大觀霉素時(shí),該雜質(zhì)峰被藥物峰所掩蓋。通過(guò)對(duì)流動(dòng)相中乙腈百分比按30%、35%、40%、45%、50%(流動(dòng)相中水的百分比作出相應(yīng)調(diào)整)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明鹽酸大觀霉素流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-水(30∶35∶35)時(shí)峰形最佳,且藥物峰與雜質(zhì)峰分離較好。

3.2.3 其他 大觀霉素樣品的溶劑為乙腈,易揮發(fā),應(yīng)密封,且應(yīng)盡快檢測(cè)完畢。

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Assay of Lincomycin and Spectinomycin in Oily Injectable Suspensions by HPLC

WANG Zhong,WANG Li-qi,LIU Xiao-qin,FAN Hui-min,HUANG Xian-hui,ZENG Zhen-ling

(College of Veterenary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

A high-performance liquid chromatographic(HPLC)method with ultraviolet-visible detection was developed to measure the concentrations of lincomycin and spectinomycin in their oily injectable suspensions.The separation was performed on a C18 column(4.6 mm ×250 mm,5 μ m),the mobile phase of lincomycin comprised of 0.05 mol/L borax solution(pH5.0,adjusted with 85%phosphoric acid)-methanol-acetonitril(60∶36∶4),UV detection was set at a wavelength of 214nm.the mobile phase of spectinomycin comprised of acetonitril,tetrahydrofuran and water(30∶35∶35),UV detection was set at a wavelength of 415 nm.The standard curves of lincomycin and spectinomycin were linear in the range between 10 μg/mL to 40 μg/mL,rthe average recoveries were 98.68%for lincomycin and 99.10%for spectinomycin,the average intraassay coefficients of variation were 0.93%for lincomycin and 0.86%for spectinomycin,and the interassay coefficients of variability were 1.68%and 0.98%,respectively.The present method was precise and convenient,and could therefore be used to quantify lincomycin and spectinomycin in oily injectable suspensions.

lincomycin and spectinomycin oily injectable suspensions;lincomycin hydrochliride;spectinomycin hydrochliride;HPLC;assay

S859.7

A

1007-5038(2011)09-0058-05

2011-02-28

十一五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD31B06)

王 忠(1985-),男,江西宜春人,碩士研究生,主要從事獸藥新制劑的研制。