金屬鋅對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管黏附分子-1表達(dá)的影響

劉衛(wèi)東 孫珉丹 董 宇 梁玲玲

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院眼一科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是以新生血管形成為特點(diǎn)的糖尿病常見(jiàn)而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是50歲以上患者重要的致盲原因，病程10～14年的糖尿病患者26%發(fā)生DR，病程15年以上者63%發(fā)生DR，DR晚期嚴(yán)重?fù)p害視力可造成不可逆盲，所以及時(shí)治療至關(guān)重要。目前對(duì)DR的治療包括激光光凝、玻璃體切除及藥物治療，各種治療方法各有利弊。本文探討金屬鋅對(duì)DR的防治作用，為臨床治療及用藥提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 健康成年雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，高脂飼料組成:普通基礎(chǔ)飼料88.8%，豬油10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%，均由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)購(gòu)自Sigma公司，4℃保存，使用前用新配制的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液在水浴下配制成2%STZ溶液，調(diào)至pH4.4，現(xiàn)配現(xiàn)用;硫酸鋅購(gòu)自北京精求化工責(zé)任有限公司，使用前配制成2%的硫酸鋅溶液備用;VCAM-1多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物有限公司，膽固醇、膽酸購(gòu)于上?；菔郎噭┯邢薰?血糖試紙購(gòu)于泰爾茂醫(yī)療產(chǎn)品(上海)有限公司;血脂、尿糖試劑購(gòu)于長(zhǎng)春匯力公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組 將36只Wistar大鼠，均適應(yīng)性飼養(yǎng)1W，隨機(jī)分為(1)正常對(duì)照組(2)高脂組(3)高脂+鋅組(4)STZ+高脂組(5)STZ+高脂+鋅組(6)STZ+高脂+后加鋅組，正常對(duì)照組使用普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);其余各組均以高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4 w后，高脂+鋅組每日硫酸鋅30 mg/kg灌胃;STZ+高脂組、STZ+高脂+鋅組、STZ+高脂+后加鋅組的大鼠禁食12 h，以STZ(用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液稀釋STZ至2%濃度，pH4.4)40 mg/kg 5 min內(nèi)腹腔注射，以空腹血糖＞16.8 mmol/L，尿糖()以上，尿量及飲水明顯增多定為高糖血癥，建立STZ糖尿病大鼠模型。同時(shí)STZ+高脂+鋅組大鼠每日給予硫酸鋅30 mg/kg灌胃;STZ+高脂+后加鋅組在建立STZ糖尿病大鼠模型后3 d每日給予硫酸鋅30 mg/kg灌胃;正常對(duì)照組及高脂組均每日給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠正常飲食水，定期測(cè)血糖、尿糖及體重。4 w后各實(shí)驗(yàn)組斷尾測(cè)血糖，輕摘眼球，取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行免疫組化。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化方法 免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(S-P法)，其操作步驟如下:(1)切片常規(guī)脫蠟、脫水。(2)PBS沖洗5 min。(3)3%H2O2-蒸餾水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶25 min。(4)PBS沖洗5 min，3次。(5)抗原修復(fù)。(6)山羊血清(1∶20)封閉30 min。(7)特異性一抗(VCAM-1多克隆抗體)于切片上，孵育40 min。(8)PBS沖洗5 min，3次。(9)滴加相應(yīng)的二抗(IgG或Biotin)，孵育40 min。(10)PBS沖洗5 min，3次。(11)加相應(yīng)的三抗(S-A/HRP)孵育40 min。(12)PBS沖洗5 min，3次。(13)DAB-蒸餾水溶液顯色。(14)Mayer蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 免疫組化結(jié)果 應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)測(cè)定視網(wǎng)膜組織VCAM-1表達(dá)量的累積光密度(integrated optical density，IOD)，并采用Imagepro-Plus軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析，再進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組，高脂組，高脂+鋅組，STZ+高脂組，STZ+高脂+鋅組，STZ+高脂+后加鋅組視網(wǎng)膜組織中VCAM-1表達(dá)水平分別為 4 960.42±3 180.97、20 776.74±12 176.17、10 388.57±1 275.22、24 273.05 ±5 102.10、15 212.52 ±5 073.17、6 846.95±1 249.94。見(jiàn)圖1。高脂組，高脂+鋅組，STZ+高脂組，STZ+高脂+鋅組，STZ+高脂+后加鋅組視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)與正常對(duì)照組比較均增高(F=10.07，P＜0.000 1);高脂+鋅組視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)與高脂組比較降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);STZ+高脂+鋅組，STZ+高脂+后加鋅組視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)與STZ+高脂組比較降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組視網(wǎng)膜組織VCAM-1表達(dá)(免疫組化，×400)

3 討論

DR基本病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜微循環(huán)異常，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜增厚，自動(dòng)調(diào)節(jié)功能障礙，乃至毛細(xì)血管閉塞，視網(wǎng)膜缺血、缺氧，新生血管形成。氧化應(yīng)激增多是已經(jīng)被公認(rèn)的DR發(fā)病的基礎(chǔ)機(jī)制，其來(lái)源包括自由基增多和氧化防護(hù)組織破壞增多〔1〕，而自由基增多也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，近年很多文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為炎癥反應(yīng)與DR的發(fā)病也密切相關(guān)，是DR的發(fā)病機(jī)制之一〔2〕。金屬硫蛋白可以清除氧自由基，是保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激損傷的抗氧化物，金屬鋅可以誘導(dǎo)金屬硫蛋白在細(xì)胞和組織中的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化作用及抗炎作用，以減少新生血管的形成〔3〕。Moriarty-Craige等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)鋅可以預(yù)防及治療糖尿病心肌病〔4〕。Tate等〔5〕的研究也發(fā)現(xiàn)補(bǔ)鋅可以抑制年齡相關(guān)性黃斑病變的發(fā)生，降低年齡相關(guān)性黃斑病變患者喪失視力的可能性。氧化應(yīng)激增多，血管通透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始變薄，細(xì)胞因子釋放增多VCAM-1等血管內(nèi)皮活化物表達(dá)隨之增加，而VCAM-1表達(dá)增加與新生血管形成密切相關(guān)〔6，7〕，有文獻(xiàn)報(bào)道DR的患者VCAM-1的表達(dá)增加，能夠促進(jìn)DR的發(fā)生發(fā)展〔8〕。試想金屬鋅是否可以通過(guò)抗氧化作用及抗炎作用降低VCAM-1的表達(dá)，從而減少新生血管的形成，達(dá)到延緩 DR發(fā)生發(fā)展的作用，所以本文選擇VCAM-1作為我們實(shí)驗(yàn)的觀察指標(biāo)，觀察金屬鋅是否能夠通過(guò)抑制VCAM-1的表達(dá)達(dá)到抑制DR的發(fā)生發(fā)展，較多國(guó)外文獻(xiàn)也報(bào)道過(guò)VCAM-1可以很好的作為評(píng)價(jià)DR合適的標(biāo)記物〔8〕，本研究中高脂組，高脂+鋅組，STZ+高脂組，STZ+高脂+鋅組，STZ+高脂+后加鋅組視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)均比正常對(duì)照組高，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高脂+鋅組中視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)比高脂組低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，STZ+高脂+鋅組，STZ+高脂+后加鋅組視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)比STZ+高脂組低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明金屬鋅可以降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)，而且還可以降低高脂組大鼠視網(wǎng)膜組織中VCAM-1的表達(dá)，其抑制炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制是通過(guò)金屬鋅對(duì)氧化應(yīng)激的抑制作用，進(jìn)一步目的抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，達(dá)到延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的。

1 Kowluru RA，Kennedy A.Therapeutic potential of anti-oxidants and diabetic retinopathy〔J〕.Expert Opin Investig Drugs，2001;10(9):1665-76.

2 Adamiec J，Oficjalska-M?yńczak J.Contribution of selected cellular adhesion molecules and proinflammatory cytokines in the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy〔J〕.Przeql Lek，2007;64(6):389-92.

3 Prasad AS，Bao B，Beck FW，et al.Antioxidant effect of zinc in humans〔J〕.Free Radic Biol Med，2004;37(8):1182-90.

4 Moriarty-Craige SE，Ha KN，Sternberg P，et al.Effects of long-term zinc upplementation on plasma thiol metabolites and redox status in patients with age-related macular degeneration〔J〕.Am J Ophthalmol，2007;143:206-11.

5 Tate DJ，Newsome DA.A novel zinc compound(zinc monocysteine)enhances the antioxidant capacity of human retinal pigment epithelial cells〔J〕.Curr Eye Res，2006;31(7-8):675-83.

6 Nowak M，Wielkoszyński T，Marek B.Blood serum levels of vascular cell adhesion molecule(sVCAM-1)，intercellular adhesion molecule(sICAM-1)and endothelial leucocyte adhesion molecule-1(ELAM-1)in diabetic retinopathy〔J〕.Clin Exp Med，2008;8(3):159-64.

7 Khalfaoui T，Lizard G，Beltaief O，et al.Immunohistochemical analysis of cellular adhesion molecules(ICAM-1，VCAM-1)and VEGF in fibrovascular membranes of patients with proliferative diabetic retinopathy〔J〕.preliminary study〔J〕.Pathol Biol，2009;57(7-8):513-7.

8 Boulanger E，Wautier JL，Dequiedt P，et al.Glycation，glycoxidation and diabetes mellitus〔J〕.Nephrol Ther，2006;2(Suppl 1):S8-16.