過(guò)敏性休克死者類胰蛋白酶和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的免疫組化染色觀察

高艷斌 盧英強(qiáng) 宣兆艷 (長(zhǎng)春市公安司法鑒定中心，吉林 長(zhǎng)春 3022)

過(guò)敏性休克死者類胰蛋白酶和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的免疫組化染色觀察

高艷斌 盧英強(qiáng)1宣兆艷1(長(zhǎng)春市公安司法鑒定中心，吉林 長(zhǎng)春 130122)

目的 觀察過(guò)敏性休克死者各器官組織中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(MCT)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子變化，探討過(guò)敏性休克死亡法醫(yī)鑒定的形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法 機(jī)械性損傷死者8例(對(duì)照組)，明確診斷為過(guò)敏性休克死亡者27例的尸體，取其肺、心、肝、脾、腎、小腸和咽喉組織，石蠟切片，HE染色及免疫組化染色和甲苯胺藍(lán)染色。結(jié)果 過(guò)敏性休克組肺、小腸、腎MCT增多，肺、小腸肥大細(xì)胞增多(P＜0.01)，小腸嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子增多(P＜0.01)%結(jié)論 過(guò)敏性休克死亡的尸體，其肺、小腸、腎MCT增多，肺、小腸肥大細(xì)胞增多，小腸嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子增多。

法醫(yī)病理學(xué);過(guò)敏性休克;肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(MCT);嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子;免疫組化

過(guò)敏性休克是臨床常見(jiàn)的急癥之一，其發(fā)病突然，難以預(yù)見(jiàn)，危及生命，尤其是藥物過(guò)敏性休克，常常是導(dǎo)致醫(yī)療糾紛和非法行醫(yī)致死的一個(gè)重要原因。其尸檢無(wú)特異性病理改變，常常使一些醫(yī)療糾紛和非法行醫(yī)案件久拖不決。本研究通過(guò)對(duì)類胰蛋白酶(MCT)!嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的免疫組化染色研究，旨在從法醫(yī)病理學(xué)角度為過(guò)敏性休克死亡的法醫(yī)鑒定提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 27例研究材料取自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室尸檢標(biāo)本，法醫(yī)病理及臨床經(jīng)過(guò)均符合過(guò)敏性休克。死者年齡0～72歲，平均(34.0±20.8)歲。8例機(jī)械性損傷的尸檢標(biāo)本作為對(duì)照，材料取自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室。所用兔抗人MCT單克隆抗體及S-P超敏法試劑盒、DAB顯色液均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。Eotaxin單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 方法 取經(jīng)10%甲醛固定的咽喉、肺、心、脾、肝、腎及小腸等組織，經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色和超敏SP法免疫組化染色，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試劑盒中隨帶的照片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間比較采用t和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 病理診斷過(guò)敏性休克死亡的肺組織明顯淤血、間質(zhì)水腫，肺泡擴(kuò)張、間隔斷裂形成肺氣腫;肺泡腔內(nèi)充滿大量粉染的水腫液，肺間質(zhì)水腫，在肺間質(zhì)可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。腸黏膜內(nèi)可見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，喉頭黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn);脾臟內(nèi)有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。其他原因死亡的肺組織、腸黏膜基本正常。

2.2 MCT染色 診斷為過(guò)敏性休克致死案例中，肺組織內(nèi)見(jiàn)大量MCT染色陽(yáng)性顆粒，呈棕黃色，主要位于血管周圍(圖1A);腸黏膜有大量MCT陽(yáng)性顆粒(圖1B);在其他組織內(nèi)也可見(jiàn)不同程度的MCT陽(yáng)性顆粒。尤其是在腎遠(yuǎn)曲小管和近曲小管，且以遠(yuǎn)曲小管為多(圖1C)，MCT陽(yáng)性顆粒多見(jiàn)。非過(guò)敏原因致死的案例中，肺、腸等組織罕見(jiàn)陽(yáng)性顆粒(圖1D、圖1E)%實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組MCT陽(yáng)性顆粒記數(shù)見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異具有顯著性(P＜0.01)%

2.3 Eotaxin染色 在過(guò)敏性休克致死的案例中，腸黏膜Eotaxin陽(yáng)性顆粒多見(jiàn)(圖1F)%而其他案例，各臟器罕見(jiàn)eotaxin陽(yáng)性顆粒。

圖1 過(guò)敏性休克死者及非過(guò)敏原因死者組織的免疫組化改變(×40)

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組MCT陽(yáng)性百分率比較

3 討論

過(guò)敏性休克屬I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，肥大細(xì)胞(mast cell，MC)是機(jī)體內(nèi)一種重要的免疫細(xì)胞，能分泌MCT、組織胺、5-羥色胺、慢反應(yīng)物質(zhì)和肝素等多種生物活性物質(zhì)，與變態(tài)反應(yīng)性疾病有著密切的關(guān)系，在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。肥大細(xì)胞MCT是肥大細(xì)胞釋放的一種活性因子，是肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)隨組胺一起釋放的，但比組胺釋放晚，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，其增多提示有過(guò)敏現(xiàn)象出現(xiàn)。

1987年，Schwartz等〔1〕發(fā)現(xiàn)在過(guò)敏性休克后，血清和血漿中MCT升高。1989年，Schwartz等〔2〕發(fā)現(xiàn)在過(guò)敏性休克后，1～2 h后血清 MCT升高，半衰期為2 h，直到4 d后，仍能檢出MCT。1998年Edston〔3〕通過(guò)放免技術(shù)測(cè)定了193具尸體血中MCT，發(fā)現(xiàn)將鑒定標(biāo)準(zhǔn)定為10 μg/L時(shí)，其特異性和準(zhǔn)確性最好。但放免有其缺點(diǎn)：試劑盒價(jià)格昂貴，且有放射性污染，不適于廣泛應(yīng)用。1999年，Enrique〔4〕采用UniCAPMCT酶聯(lián)免疫熒光法來(lái)測(cè)定MCT，該法更準(zhǔn)確，而且沒(méi)有放射性污染。1999年，F(xiàn)ineschi等〔5〕對(duì)1例過(guò)敏性休克死亡的病人取肺作了免疫組化，發(fā)現(xiàn)肺MCT升高。2010年，王昌亮等〔6〕通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)敏豚鼠肺組織中MCT和胃促胰酶的表達(dá)明顯增強(qiáng)。

MCT主要通過(guò)蛋白酶激活受體2(PAR-2)起作用。PAR-2在心血管、氣道、腸、神經(jīng)等組織中均有表達(dá)。MCT是最有效的PAR-2激活劑，能夠裂解許多組織、細(xì)胞的PAR-2受體。某些疾病發(fā)生時(shí)，PAR-2受體在組織中的表達(dá)可有變化。如IgA腎病時(shí)，腎近曲小管和腎間質(zhì)PAR-2受體表達(dá)增強(qiáng)〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過(guò)敏性休克致死案例，腎遠(yuǎn)曲小管和近曲小管內(nèi)MCT顆粒較多，且遠(yuǎn)曲小管內(nèi)為多。因MCT為蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是在近曲小管重吸收的，故推測(cè)遠(yuǎn)曲小管PAR-2受體表達(dá)增強(qiáng)。

Eotaxin是一種嗜酸性粒細(xì)胞選擇性化學(xué)趨化因子，對(duì)于其他類型的白細(xì)胞作用微弱，這明顯不同于所有其他的趨化因子。Eotaxin也被證實(shí)是一種強(qiáng)有力的嗜酸性粒細(xì)胞激活劑，能夠誘導(dǎo)過(guò)氧化物的產(chǎn)生并釋放蛋白質(zhì)顆粒。給予豚鼠、嚙齒類動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)注射Eotaxin，嗜酸性粒細(xì)胞是唯一聚集的細(xì)胞，說(shuō)明Eotaxin對(duì)于嗜酸性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的優(yōu)先選擇性，對(duì)其他類型白細(xì)胞則影響較小。

Eotaxin在體內(nèi)多種正常細(xì)胞，如皮膚、支氣管上皮、腸道上皮、胸腺和骨骼肌均有結(jié)構(gòu)性表達(dá)。當(dāng)受到各種炎癥刺激后，表達(dá)顯著增高。大量的研究表明，支氣管哮喘時(shí)，氣道黏膜Eotaxin表達(dá)顯著增強(qiáng)，其表達(dá)強(qiáng)度與支氣管壁嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及與哮喘嚴(yán)重度呈顯著正相關(guān)〔8〕。過(guò)敏性皮炎時(shí)，皮損區(qū)的表皮細(xì)胞和皮下炎癥細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞)中，Eotaxin和MCP 4的mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，其表達(dá)水平與病灶內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)相關(guān)〔9〕。

本研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜Eotaxin陽(yáng)性顆粒多見(jiàn)，與HE染色腸黏膜嗜酸性粒細(xì)胞較多相符。說(shuō)明Eotaxin是過(guò)敏性休克時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞聚集的主要原因。

1 Schwartz LB，Metcalfe DD，Miller JS，et al.Tryptase levels as an indicator of mast-cell activation in systemic anaphylaxis and mastocytosis〔J〕.N Engl J Med，1987;316(26)：1622-6.

2 Schwartz LB，Yunginger JW，Miller J.Time course of appearance and disappearance of human mast cell tryptase in the circulation after anaphylaxis〔J〕.J Clin Invest，1989;83(5)：1551-5.

3 Edston E，van Hage-Hamsten M.β-tryptase measurements post-mortem in anaphylactic death and in controls〔J〕.For Sci Int，1998;9(3)：135-42.

4 Enrique E，Carcia-Ortega P，Sotorra O，et al.Usefulness of unicap-tryptase fluoroimmunoassay in the diagnosis of anaphylaxis〔J〕.Allergy，1999;54(6)：602-6.

5 Fineschi V，Monasterolo G，Rosi R，et al.Fatal anaphylactic shock during a fluorescein angiography〔J〕.For Sci Int，1999;100(1-2)：137-42.

6 王昌亮，張國(guó)華，吳 旭，等.豚鼠過(guò)敏休克肺組織中類胰蛋白酶和胃促胰酶的表達(dá)〔J〕.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2010;125(4)：236-9.

7 Giuseppe G，Paola P，Giuseppina C，et al.Protease-activated receptor-2 expression in IgA nephropathy：a potential role in the pathogenesis of interstitial fibrosis〔J〕.J Am Soc Nephrol，2003;14：2072-83.

8 Humbles AA，Conroy DM，Marleau S，et al.Kinetics of eotaxin generation and its relationship to eosinophil accumulation in allergic airways disease analysis in a guinea pig model in vivo〔J〕.J Exp Med，1997;186：601-12.

9 Taha RA，Minshall EM，Leung DY，et al.Evidence for increased expression of eotaxin and monocyte chemotactic protein-4 in atopic dermatitis〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2000;105：1002-7.

R34

A

1005-9202(2011)10-1822-02

1 吉林大學(xué)法醫(yī)學(xué)系

宣兆艷(1964-)，女，副教授，主要從事法醫(yī)病理和法醫(yī)臨床研究。

高艷斌(1976-)，男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

〔2010-12-14收稿 2011-03-15修回〕

(編輯 曲 莉)