SD大鼠阿霉素慢性心力衰竭模型的建立與評(píng)價(jià)

吳運(yùn)香，張 野，謝春林，張書杰，解 翔，姜 凡，陳志武

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.麻醉科、2.超聲診斷科，安徽合肥 230601;3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

慢性心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的健康。用于心力衰竭研究的動(dòng)物模型較多［1］，如壓力超負(fù)荷模型［2］，藥物所致的心肌病等。阿霉素(adriamycin，ADR)是臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，因其與心臟組織的高親和力而具有明顯的心臟毒性［3－6］。國(guó)外很早就有關(guān)于阿霉素心肌病的研究［3－4］，但目前對(duì)于阿霉素心力衰竭的動(dòng)物模型說(shuō)法不一［5－6，9－11］，動(dòng)物死亡率相對(duì)較高;本實(shí)驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)期多次靜脈給予阿霉素成功建立了一種非缺血性慢性心力衰竭模型，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，為慢性心力衰竭相關(guān)研究提供了良好的模型。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年♂SD大鼠28只，體質(zhì)量(235±15)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(皖)2005-001］。

1.2主要藥品試劑與儀器鹽酸阿霉素，批號(hào):9QL1038，購(gòu)自Prizer Italia S.r.l;Hema TGL-16R 冷凍高速離心機(jī)，珠海黑馬儀器有限公司;Vivid 7.0彩色超聲儀，美國(guó)GE公司;血漿腦利鈉肽(BNP，brain natriuretic peptide)酶聯(lián)免疫試劑盒，批號(hào):201001118，上海森雄生物有限公司;SPECTRA MAX 190酶標(biāo)分析儀，美國(guó)Sigma公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備及分組參照文獻(xiàn)［1］方法并加以改進(jìn)，所有大鼠隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組(CON，n=8)和阿霉素心力衰竭組(ADR，n=20)。將ADR組大鼠置于自制大鼠固定器中，37～45℃溫水浸泡1 min，酒精擦拭后用24G套管針尾靜脈注射阿霉素2 mg·kg－1，藥物濃度稀釋至0.5 g·L－1，每周1 次，共 6 周，累積總量達(dá) 12 mg·kg－1，末次注射完成2周后測(cè)定心功能和形態(tài)學(xué)指標(biāo);CON組大鼠給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液，周期同ADR組。

1.3.2超聲心動(dòng)圖CON組與ADR組8周后存活的大鼠，行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。腹腔注射戊巴比妥25 mg·kg－1行全身麻醉［7］，固定后左前胸備皮，并用體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇消毒。采用GE Vivid 7.0超聲儀12L探頭，頻率13MHz經(jīng)胸高頻超聲檢查，在二維超聲引導(dǎo)下用M型超聲經(jīng)胸骨左心長(zhǎng)軸切面測(cè)量左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)，左心室收縮末內(nèi)徑(LVESD)，求3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，并按照Teichholtz公式;LVEF=［(100－Y)×0.15］+Y;Y=［(LVEDD2－LVESD2)］×100/LVEDD2;LVFS=(LVEDD－LVESD)×100/LVEDD，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)。

1.3.3BNP的測(cè)定頸動(dòng)脈取血1.0 ml，冷凍高速離心機(jī)3 000 r·min－1離心8 min，取上清，－20℃保存待測(cè)。ELISA法測(cè)定BNP水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明。

1.3.4心肌組織形態(tài)學(xué)觀察大鼠取血后取其心臟，置生理鹽水中沖洗殘血。取心室肌組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色和VG染色，顯微鏡觀察并攝片，JEOR 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Version 6.0)測(cè)量并參照文獻(xiàn)［8］所述方法計(jì)算心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF，collagen volume fraction)及心肌血管周圍膠原面積(PCVA，perivascular circumferential collagen area)。CVF(%)=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積;PCVA(%)=心室內(nèi)小動(dòng)脈管腔周圍膠原面積/動(dòng)脈管腔面積。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用±s表示，采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1一般情況與存活率ADR組大鼠在造模過(guò)程中陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡，進(jìn)食減少，體重增長(zhǎng)緩慢或下降，活動(dòng)量下降，口唇及足趾發(fā)紺等慢性心力衰竭的癥狀。ADR組大鼠存活20只，死亡12只，存活率為62.5%。CON組大鼠均存活。

2.2超聲心動(dòng)圖心功能比較造模8周末超聲心動(dòng)圖測(cè)定兩組大鼠心功能。ADR組大鼠心室腔擴(kuò)大，心室壁厚度增加，LVEDD，LVESD增加，但僅LVESD與CON組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);LVEF及 LVFS明顯降低(P＜0.01)，顯示有左室收縮功能障礙。CON組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查未見(jiàn)明顯心功能異常，見(jiàn)Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Comparison of left ventricular function by echocardiography between CON and ADR groups after 8 weeks

2.3血漿腦利鈉肽(BNP)水平的測(cè)定與CON組相比，ADR組大鼠血漿BNP水平明顯升高(P＜0.01)，見(jiàn)Tab 2。

2.4心肌組織形態(tài)學(xué)改變HE染色可見(jiàn)，CON組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，心肌間隙正常，無(wú)炎性滲出;ADR組心肌細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)呈溶解狀態(tài)，核深染;可見(jiàn)心肌纖維溶解斷裂，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，或有紅細(xì)胞沉積，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)Fig 2A-B。VG染色顯示心肌細(xì)胞呈黃色，膠原纖維呈紅色，見(jiàn)Fig 2C-F。心肌膠原含量半定量分析顯示，與CON組相比，ADR組心肌間質(zhì)CVF和血管周圍 PCVA明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn) Fig 2G-H。

Tab 1 Comparison of body weight and left ventricular function by echocardiography between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

Tab 1 Comparison of body weight and left ventricular function by echocardiography between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

HR:heart rate;BW:body weight;LVEDD:left ventricular end-diastolic diameter;LVESD:left ventricular end-systolic diameter;LVFS:left ventricular fractional shortening;LVEF:left ventricular ejection fraction.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON group

Group BW/g HR/bpm LVEDD/mm LVESD/mm LVFS/% LVEF/%CON(n=8)371 ±13 402 ±18 6.80 ±0.48 3.20 ±0.34 53.86 ±2.0081.89 ±1.56 ADR(n=20)282±25* 394±16 7.10±0.36 4.90 ±0.26＊＊ 30.19±1.40＊＊ 58.56 ±1.68＊＊

Fig 2 Comparison of pathological changes and collagen content at the end of eighth week by HE and VG stain(HE ×400，A-B)(VG ×400，CF)HE staining×400 A:CON group;B:ADR group;VG staining×400 Myocardial interstitial fibrosis，C:CON group;D:ADR group;Perivascular fibrosis E:CON group;F:ADR group G:Statistic results of myocardial interstitial fibrosis;H:Statistic results of perivascular fibrosis.＊＊P ＜0.01 vs CON group

Tab 2 Comparison of the level of brain natriuretic peptide(BNP)by ELISA between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

Tab 2 Comparison of the level of brain natriuretic peptide(BNP)by ELISA between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

＊＊P＜0.01 vs CON group

Group BNP/ng·L －1 CON(n=8)38.4 ±4.8 ADR(n=20)104.9 ±7.4＊＊

3 討論

本研究選取可致心肌毒性的阿霉素［2－3］制作慢性心力衰竭模型。阿霉素致心力衰竭主要是由于心肌組織自由基的生成引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化，損害了細(xì)胞膜的完整性［9］。單次［11］或多次［5，10］給藥后長(zhǎng)期觀察，可建立阿霉素慢性心肌毒性模型，動(dòng)物出現(xiàn)心肌病后，損害進(jìn)一步加重則可演變成為心力衰竭［1］;阿霉素心臟損害的發(fā)生率及程度與其在體內(nèi)的蓄積量有直接關(guān)系［4］，具有時(shí)間累積效應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外制作慢性阿霉素心肌病模型的方法很多，但藥物劑量和給藥方式各不相同。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，參照Lu等［8－10］的方法以總量15 mg·kg－1于2周內(nèi)腹腔注射阿霉素6次或是總量24 mg·kg－1以4 mg·kg－1每周 1 次腹腔給藥等方法，模型死亡率高，可重復(fù)性差?？赡苁怯捎谒幬镄r(jià)不同或動(dòng)物種屬的差異;且腹腔注射會(huì)導(dǎo)致腹部皮膚局部壞死，大量藥物局部刺激腹腔，胃腸道毒性更明顯;實(shí)驗(yàn)者最終選定2 mg·kg－1尾靜脈給藥，為確保給藥量和延長(zhǎng)給藥時(shí)間，選擇靜脈留置針注射;注藥結(jié)束后用少量生理鹽水沖洗，減少藥物殘留和對(duì)局部血管壁的刺激。使用大鼠固定器實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠清醒狀態(tài)的靜脈注藥，避免了多次麻醉對(duì)大鼠的影響;每周1次的給藥間隔制作大鼠心力衰竭模型，操作簡(jiǎn)單且較穩(wěn)定。

目前實(shí)驗(yàn)研究常用的判斷心力衰竭模型的方法［2，13］有心重/體重，有創(chuàng)的心功能的測(cè)定，觀察心肌組織形態(tài)學(xué)的改變，均需處死大鼠;本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)定尾靜脈注射阿霉素8周末大鼠的心功能，即通過(guò)一種無(wú)創(chuàng)的方式判定大鼠心力衰竭與否;與CON組相比，ADR組大鼠心功能明顯降低，與Schwarz等［5］所述相一致。眾多的臨床實(shí)驗(yàn)和研究［12－13］已證實(shí)，BNP水平與左心室舒張末壓呈正相關(guān)，與左心室功能呈負(fù)相關(guān);心力衰竭時(shí)BNP水平明顯升高，與心力衰竭程度呈正相關(guān);可用于診斷心力衰竭并依據(jù)其水平判斷心力衰竭的程度和預(yù)后，并可結(jié)合超聲心動(dòng)圖指標(biāo)和心血管危險(xiǎn)因素提高BNP診斷心力衰竭的敏感性和特異性。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)觀察大鼠一般情況，超聲心動(dòng)圖測(cè)定其心功能，HE染色和VG染色觀察其組織形態(tài)學(xué)的改變，均說(shuō)明ADR組大鼠心力衰竭模型是成功的;ADR組大鼠血漿BNP水平升高進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)。

考慮到麻醉對(duì)心功能，特別是心力衰竭大鼠心功能［14］的影響，參照Stein［7］等的方法采用腹腔注射小劑量戊巴比妥，不僅能夠達(dá)到與大鼠清醒狀態(tài)相似的左心室結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)，而且使測(cè)量更容易且精準(zhǔn)。

綜上所述，多次尾靜脈注射阿霉素可以建立穩(wěn)定可靠的慢性心力衰竭模型，且可通過(guò)超聲心動(dòng)圖進(jìn)行無(wú)創(chuàng)的判定，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高;可用于慢性心力衰竭的相關(guān)研究，也可為在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的心臟保護(hù)策略的研究奠定了基礎(chǔ)。

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