外源性多胺對(duì)老年大鼠抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究

薛 過，王偉偉，趙雅君，張偉華，王麗娜，李紅霞，張 力，徐長(zhǎng)慶

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150001)

衰老是一種自然現(xiàn)象，自由基學(xué)說和慢性炎性反應(yīng)學(xué)說是目前解釋衰老機(jī)制的兩個(gè)重要學(xué)說，大量實(shí)驗(yàn)研究證明減少體內(nèi)自由基產(chǎn)生、抑制炎癥反應(yīng)能防治衰老性疾?。?－2］。體內(nèi)的天然物質(zhì)多胺包括腐胺、精脒和精胺參與體內(nèi)多種生理和病理過程，如穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化及抗凋亡等［3－5］。近年來關(guān)于多胺的研究取得了較多的進(jìn)展，不僅以多胺代謝通路為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的抗腫瘤藥物也為惡性腫瘤的靶向治療提供良好的發(fā)展前景［6－8］，其在抗衰老方面作用的研究也有了新的發(fā)現(xiàn)［9］。本研究擬通過對(duì)自然衰老大鼠灌服多胺，觀察外源性多胺對(duì)自然衰老大鼠心臟、肝臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響，為多胺抗衰老作用機(jī)制的研究提供新的資料。

1 材料與方法

1材料

1.1主要試劑腐胺、精脒、精胺 (均購(gòu)自Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào):970912，20041020)，大鼠 IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中杉生物技術(shù)公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2主要儀器Beckman低溫離心機(jī);US-640型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)，Beckman公司);BIO-RAD酶標(biāo)儀(Model550美國(guó)，BioTek公司);恒溫水浴鍋(國(guó)產(chǎn))。

2 方法

2.1動(dòng)物給藥及實(shí)驗(yàn)分組Wistar大鼠，清潔級(jí)，♂，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，室溫20～22℃，光照充足，給予充足的標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。實(shí)驗(yàn)分3組，多胺給藥組(polyamines):18月齡Wistar大鼠，體質(zhì)量(500±50)g，多胺灌胃(精脒濃度0.01 mg·g－1，精胺濃度0.1 mg·g－1)，每天 1 次，灌胃容量 0.01 ml·g－1，連續(xù)給藥6周，末次給藥后禁食(不禁水)12 h取材。老年對(duì)照組(old):與給藥組大鼠月齡相同、體重相當(dāng)?shù)睦夏甏笫螅杂娠嬎⑦M(jìn)食。青年對(duì)照組(young):體質(zhì)量(280±20)g，自由飲水、進(jìn)食的3月齡Wistar大鼠。

2.2大鼠心臟及肝臟組織SOD活力、MDA含量檢測(cè)各組動(dòng)物均給予體積分?jǐn)?shù)為0.2的烏拉坦0.005 ml·g－1腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔取出心臟、打開腹腔取出肝臟，在冷的生理鹽水中漂洗、拭干。取心臟左心室及肝臟右側(cè)葉，稱重，加入10倍體積預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴中制成組織勻漿，4℃12 000×g離心10 min，上清貯存在－80℃直至分析使用。按照試劑盒說明書測(cè)定SOD活力、MDA含量。BCA法測(cè)蛋白含量。

2.3大鼠心臟及肝臟組織IL-1β和TNF-α含量測(cè)定取制備好的組織勻漿，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法按照試劑盒說明書測(cè)定 IL-1β和TNF-α含量。BCA法測(cè)蛋白含量。

2.4心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠左心室心尖部約3.0×4.0×1.0(mm3)大小組織，置于戊二醛磷酸緩沖液中固定30 min，然后改刀切成體積約1～2(mm3)的小塊，4℃繼續(xù)固定24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用±s表示，各組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1多胺對(duì)衰老大鼠心臟組織中SOD活力、MDA含量的影響與青年對(duì)照組相比，老年對(duì)照組心肌組織SOD活力明顯降低、MDA含量明顯升高，差異均有顯著性;與老年對(duì)照組相比，多胺給藥組心肌組織SOD活力明顯提高、MDA含量明顯降低，差異均有顯著性，見Tab 1。

Tab 1 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in cardiac tissue in aging rats(±s)

Tab 1 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in cardiac tissue in aging rats(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs young group;#P＜0.05 vs old group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA//μmol·g－1Pro Young 9 348.77 ±63.71 5.28 ±0.77 Old 9 225.57 ±56.55* 10.22 ±2.15＊＊Polyamines 7 346.08 ±18.23# 6.19 ±0.96#

3.2多胺對(duì)衰老大鼠肝臟組織中SOD活力、MDA含量的影響與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組肝臟組織SOD活力明顯降低、MDA含量明顯升高，差異均有顯著性;與老年對(duì)照組相比，多胺給藥組肝臟組織SOD活力明顯提高、MDA含量明顯降低，差異均有顯著性，見Tab 2。

Tab 2 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in liver tissue in aging rats(±s)

Tab 2 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in liver tissue in aging rats(±s)

＊＊P ＜0.01 vs young group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs old group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Young 9 129.09 ±28.24 0.68 ±0.13 Old 9 101.36 ±14.81＊＊ 1.31 ±0.32＊＊Polyamines 7 129.60 ±34.13# 0.83 ±0.22##

3.3多胺對(duì)衰老大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β水平的影響與青年對(duì)照組相比，老年對(duì)照組心肌組織TNF-α與IL-1β含量均明顯升高，差異均有顯著性;與老年對(duì)照組相比，多胺給藥組心肌組織TNF-α與IL-1β含量均明顯降低，差異均有顯著性，見Tab 3。

Tab 3 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in cardiac tissue in aging rats(±s)

Tab 3 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in cardiac tissue in aging rats(±s)

＊＊P＜0.01 vs young group;##P＜0.01 vs old group

Group n TNF-α/g·L－1 IL-1β/g·L －1 Young 9 16.14 ±4.17 45.37 ±3.98 Old 9 28.41 ±6.09＊＊ 64.76 ±7.25＊＊Polyamines 7 18.52 ±4.32## 47.19 ±5.64##

3.4多胺對(duì)衰老大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β水平的影響多胺給藥組與老年對(duì)照組相比，肝臟組織TNF-α、IL-1β含量均明顯降低，差異有顯著性。見Tab 4。

Fig 1 The morphology change in cardiac tissue of wistar rats under electron microscope

Tab 4 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in liver tissue in aging rats(±s)

Tab 4 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in liver tissue in aging rats(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs old group

Group n TNF-α/g·L－1 IL-1β/g·L －1 Young 9 69.55 ±7.63 75.91 ±4.73 Old 9 86.18 ±18.58 91.41 ±13.22 Polyamines 7 50.51 ±7.76＊＊ 70.73 ±16.66*

3.5多胺對(duì)衰老大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變的影響透射電鏡下可見青年大鼠心肌肌絲排列整齊，線粒體密集、基質(zhì)致密、線粒體嵴清晰，未見脂褐素顆粒;老年大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)可見線粒體數(shù)目減少、體積增大、基質(zhì)疏松、線粒體嵴呈絮狀變，并可見大量脂褐素顆粒沉積;多胺給藥組與老年對(duì)照組比較，心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷變化明顯減輕，可見心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，線粒體基質(zhì)較致密，線粒體嵴排列整齊，偶見脂褐素顆粒。見Fig 1。

4 討論

大量實(shí)驗(yàn)證明，隨增齡機(jī)體組織細(xì)胞氧自由基生成增加而清除能力降低，導(dǎo)致活性氧族(ROS)在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積，ROS通過與細(xì)胞脂類、蛋白質(zhì)及核酸等發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，損傷細(xì)胞［1］。衰老機(jī)體的氧化應(yīng)激可介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)［2］。研究證實(shí)，與健康青年對(duì)照組比較，健康老齡組血清中 TNF-α，IL-1β，IL-6 的水平明顯增加［10］。基于此，本研究觀察了多胺(精脒、精胺)對(duì)老齡大鼠心臟、肝臟組織氧化應(yīng)激水平及炎癥介質(zhì)生成的影響。結(jié)果顯示，慢性給予老齡大鼠外源性多胺，能明顯提高老年大鼠心臟、肝臟組織中SOD活力，降低MDA含量及TNF-α和IL-1β水平。說明多胺可通過提高組織細(xì)胞的抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，減輕炎癥反應(yīng)。線粒體是自由基產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，老化使線粒體呼吸鏈電子傳遞功能下降，電子漏出增加，ROS生成增多，過量產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)線粒體衰老［11］。脂褐素是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中不同產(chǎn)物組分的堆積，是衰老的標(biāo)志物［12］。本研究超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，外源性多胺能明顯抑制衰老大鼠心肌組織中脂褐素的形成及心肌線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變。因此，我們推測(cè)，多胺可能通過抗氧化、抗炎機(jī)制發(fā)揮抗衰老作用。

多胺具有廣泛的生物學(xué)作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)精胺可通過抗氧化、抗凋亡機(jī)制保護(hù)心肌缺血－再灌注損傷［13－15］。也有文獻(xiàn)報(bào)道，多胺能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠血清中炎癥介質(zhì)的釋放［4］;多胺可通過清除羥自由基，維持谷胱苷肽和巰基的還原狀態(tài)，抑制線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放等［3］。本研究我們證實(shí)外源性多胺可能通過抗氧化、抗炎機(jī)制延緩自然衰老大鼠的衰老進(jìn)程，為抗衰老研究提供了新思路，但其具體在細(xì)胞及分子水平上的準(zhǔn)確作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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