舒尼替尼對EGFR TKI抵抗的A549細胞株增殖抑制作用及機制研究

潘 峰，田 靜，張旭超，潘躍銀

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，安徽 合肥 230032;3.廣東省肺癌研究所，廣東廣州 510080)

肺癌是腫瘤患者死亡的主要原因，每年大約118萬人死于肺癌［1］，其中非小細胞肺癌大約占總數(shù)的80%［2］，大多數(shù)患者(80%)在就診時已屬中晚期，5年生存率僅約15%。目前藥物治療是晚期非小細胞肺癌治療的重要手段之一，但總的治療效果并不令人滿意［3］。

肺癌的靶向治療是當前研究的熱點，EGFR TKI如吉非替尼和厄洛替尼已經(jīng)被批準用于肺癌的二線治療。對EGFR激活突變患者能夠從治療中明顯獲益［4-5］，然而非小細胞肺癌中EGFR突變的發(fā)生率僅為10% ～30%［6］，同時 K-ras突變和 EGFR突變相互排斥，含有K-ras突變和EGFR野生型患者對EGFR TKI表現(xiàn)耐藥，幾乎不能從治療中獲益。Schneider等［7］研究發(fā)現(xiàn) K-ras突變和生存減少有關(guān)。因此探討如何改善EGFR TKI耐藥患者的生存，尋找新的治療藥物及方案是非常必要的。

舒尼替尼(sunitinib)是一種小分子多靶點的酪氨酸酶抑制劑，當前被FDA批準作為腎癌和對伊馬替尼抵抗的胃腸道間質(zhì)瘤的治療［8］。已有研究［9-11］發(fā)現(xiàn)sunitinib在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺癌等其他實體腫瘤中顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。本研究旨在初步探討sunitinib在EGFR TKI耐藥的非小細胞肺癌A549細胞株的增殖抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料人非小細胞肺癌細胞A549細胞株由廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(廣東省肺癌研究所)提供。Sunitinib購自Pfizer公司，胎牛血清和RPIM1640購自HyClone公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，噻唑藍(MTT)購自Sigma公司，Annexin V-EGFP購自 Millipore，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自羅氏公司，Bcl-2、β-actin抗體購自CST(Cell Signal Technology)公司，酶標儀購自 BioTek Instruments(BioTek Instruments公司，美國)，流式細胞儀購自BeckMan(BeckMan Coulter公司，美國)

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素100 U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1)、5%CO2孵箱、37℃恒溫培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代，每1～2天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞形態(tài)的觀察取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，每孔100 μl，細胞密度為3.5 ×107個·L-1，種于 96 孔板中，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加藥分組，分別作用24、48、72 h后顯微鏡下觀察藥物作用后細胞形態(tài)等變化。

1.2.3MTT法檢測sunitinib對A549細胞的增殖抑制作用取對數(shù)生長期細胞，以3.5×107個·L-1種于96孔板中，每孔100 μl。次日貼壁后，分為細胞對照組(僅含細胞和培養(yǎng)基而不含藥物的孔)、空白對照組(僅含培養(yǎng)基而不含細胞的孔)，和6個以2倍濃度稀釋的藥物組，每組6個復(fù)孔，實驗中止前4 h 每孔加20 μl的5 g·L-1MTT，培養(yǎng)4 h 后，每孔加入150 μl DMSO，輕輕搖晃10 min，以空白對照調(diào)零，在570 nm波長用自動酶標儀測定每孔的吸光度(A)值。①細胞抑制率=1-(加藥組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)×100%。②CompuSyn軟件計算單藥處理組在24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4Annexin V-EGFP熒光染色觀察細胞凋亡取對數(shù)生長期細胞，以1×108個·L-1濃度接種于6孔板，次日細胞貼壁后加入 3.5 μmol·L-1和 7.0 μmol·L-1的sunitinib濃度作用24 h誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，并設(shè)立對照，作用時間結(jié)束時用PBS洗滌細胞兩次，加入混勻好的試劑〔Binding Buffer、Annexin V-EGFP、碘化丙啶(PI);比例為100 ∶1 ∶1〕，均勻覆蓋6孔板底面，避光、室溫反應(yīng)5 min。于熒光顯微鏡下觀察，拍照，Annexin V-EGFP熒光信號為綠色，PI熒光信號為紅色。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測sunitinib對A549細胞株細胞周期的影響取對數(shù)生長期的細胞，以1×108個·L-1濃度接種于6孔板中，次日貼壁后，加入3.5 μmol·L-1的sunitinib，同時設(shè)立對照組，培養(yǎng)細胞72 h后，吸除培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，胰酶消化，懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管，離心后，去上清，加入DAPI染液，避光反應(yīng)10 min后，流式細胞儀上機檢測，用WM-cycle軟件分析細胞周期分布。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Western blot檢測Bcl-2蛋白的表達水平取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后以3×108個·L-1濃度接種入細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。次日貼壁后，分別加入 1.75、3.5 和 7.0 μmol·L-1濃度的 sunitinib 作用72 h后，提取各處理組及對照組蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品(50 μg/孔)加入10%濃度的SDS-聚丙烯凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗(1∶1 000)孵育過夜，常溫下二抗孵育1 h，然后轉(zhuǎn)入暗室加ECL發(fā)光液，膠片曝光。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，代表至少3次實驗，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，各組的組間均數(shù)比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1sunitinib對A549細胞體外增殖的影響sunitinib作用A549細胞24、48、72 h后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)死亡細胞和碎片增多、細胞密度下降、細胞固縮融合。不同濃度不同時間sunitinib對A549細胞增殖抑制率的影響如(Fig 1)所示，sunitinib能夠明顯抑制細胞的生長，并且隨著時間的延長和劑量增加，抑制作用逐漸增強，具有時間和劑量依賴性，且72 h的抑制率＞90%。sunitinib對A549細胞在24 h、48 h、72 h 的 IC50分別為(7.34 ± 0.76)、(5.54± 0.62)、(3.68 ± 0.53)μmol·L-1。

Fig 1 Antiproliferative effects of sunitinib 24 h，48 h，72 h on A549 cells by MTT(±s)

Fig 2 The changes of apoptosis on A549 exposed to sunitinib by fluorescence microscope

2.2熒光顯微鏡觀察sunitinib誘導(dǎo)A549細胞株凋亡sunitinib作用A549細胞24 h后，同對照組相比，處理組凋亡細胞明顯增多，細胞出現(xiàn)核固縮、體積縮小，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的紅色熒光。且隨著藥物濃度的增加，處于凋亡晚期細胞明顯增多，結(jié)果見Fig 2。

2.3sunitinib單藥對A549細胞周期的影響sunitinib作用于A549細胞72 h后，正常狀態(tài)下的A549細胞大多數(shù)處于G1和S期，G2/M期最少。經(jīng)sunitinib處理后，G0/G1期比例增加(P=0.012)，S期細胞的比例減少(P=0.01)。結(jié)果如Fig 3A，3B所示。

Fig 3A Cell cycle analysis on A549 cells treated with sunitinib for 72 h by flow cytometry(±s)

Fig 3B The proportion of cell cycle on A549 cells treated with sunitinib for 72 h by flow cytometry

2.4不同濃度sunitinib對A549細胞Bcl-2蛋白表達的影響使用不同濃度sunitinib作用A549細胞后，如Fig 4A，B所示，同對照組相比，各個劑量組sunitinib均能夠降低Bcl-2蛋白的表達水平(P＜0.05)，且隨著藥物濃度的增大，Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低(P＜0.05)。

Fig 4A Effects on the expression of Bcl-2 on A549 cells in different concentrations of sunitinib

Fig 4B Relative Bcl-2 levels to control

3 討論

吉非替尼和厄洛替尼是當前被批準用于肺癌治療的靶向藥物，但其在復(fù)發(fā)的晚期非小細胞肺癌中的有效率僅為10% ～19%［12-13］。EGFR野生型和K-ras突變的非小細胞肺癌并不能從EGFR TKI治療中受益。肺癌發(fā)病機制復(fù)雜，腫瘤血管生成和多種信號通路的激活在其惡性進展中起著關(guān)鍵作用，其中血管生成影響絕大多數(shù)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。當抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)旁路時，能夠使絕大多數(shù)腫瘤臨床癥狀明顯改善［14-15］。因此多靶點治療可能比單靶點治療非小細胞肺癌更有效。

sunitinib是一種小分子多靶點的酪氨酸酶抑制劑，它能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子受體-1/2(VEGFR-1/2)，血小板源性生長因子受體(PDGFR)、集落刺激因子受體-1(CSF-1R)、干細胞生長因子受體(c-KIT)、FMS樣的酪氨酸激酶3(FLT3)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(RET)［8］。臨床前及臨床研究均顯示出sunitinib具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)sunitinib在乳腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、非小細胞肺癌等腫瘤中的具有抗腫瘤效應(yīng)［16-18］，臨床前研究也發(fā)現(xiàn)sunitinib能夠明顯抑制非小細胞肺癌移植瘤模型［19］。

本實驗通過研究sunitinib作用于耐EGFR TKI非小細胞肺癌A549細胞株，發(fā)現(xiàn)其對細胞有增殖抑制作用，且具有時間和劑量的依賴性，同時72 h的抑制率＞90%。提示sunitinib可能成為對EGFR TKI耐藥的非小細胞肺癌的新的靶向治療藥物，體外實驗的藥物濃度可以為今后的體內(nèi)研究及臨床用藥提供實驗室依據(jù)。

同時發(fā)現(xiàn)sunitinib處理后的A549細胞出現(xiàn)細胞核固縮、細胞核染色質(zhì)聚集、碎裂或溶解等細胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變，且隨著藥物濃度的增大，處于晚期凋亡細胞的比例增多。表明sunitinib誘導(dǎo)凋亡可能是其抗增殖作用的機制之一。

通過流式細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，sunitinib為細胞周期特異性阻滯藥物，能夠誘導(dǎo)細胞阻滯在G0/G1期，這一結(jié)果和Hui等［20］研究結(jié)果相一致，sunitinib可能通過阻止細胞進入細胞周期的下個時段S期，抑制細胞的生長增殖進而誘發(fā)凋亡。Bcl-2家族是當前研究最多的與細胞凋亡相關(guān)的原癌基因，它在正常和腫瘤細胞的生長過程中均起著重要作用，其表達產(chǎn)物Bcl-2蛋白是一種能夠抑制細胞凋亡的抗凋亡蛋白，該蛋白表達上調(diào)與不良預(yù)后有著直接關(guān)聯(lián)，表達下調(diào)能夠增強腫瘤對凋亡的敏感性。在非小細胞肺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，抑制磷酸化AKT蛋白表達，可以下調(diào) Bcl-2 的表達［21］。Yang 等［22］研究顯示sunitinib可以通過抑制STAT和PI3K/AKT等信號通路而提高凋亡，這些研究結(jié)果提示STAT、PI3K/AKT等信號通路可能參與了Bcl-2表達的調(diào)控。本實驗通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)，sunitinib能夠下調(diào)Bcl-2的表達水平，且隨著藥物濃度的增加Bcl-2蛋白的表達逐漸降低，提示sunitinib誘導(dǎo)A549凋亡可能是通過抑制PI3K/AKT等信號通路而下調(diào)Bcl-2蛋白表達有關(guān)。

sunitinib對A549細胞具有抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其機制可能與誘導(dǎo)細胞周期阻滯和下調(diào)Bcl-2的表達有關(guān)。該項研究可以為sunitinib對耐EGFR TKI的非小細胞肺癌的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。但是，sunitinib是多靶點的靶向藥物，抗腫瘤機制較為復(fù)雜，仍需深入研究探討。

(致謝:感謝吳一龍教授給本實驗提供實驗平臺。)

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