海參巖藻聚糖硫酸酯抑制小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移及其作用機制的研究

張 珣，王靜鳳，楊玉紅，常耀光，薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003)

海參中含有海參多糖、海參皂苷、脂肪酸和多肽等多種生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗衰老和降血脂等多種生理功效［1］。多糖是海參體壁的主要成分，包括硫酸軟骨素及巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan，F(xiàn)UC)兩種組分。海參硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)和生理活性被廣泛關(guān)注，研究表明其具有抗凝血、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等生理活性［2－3］。而海參巖藻聚糖硫酸酯是一類主要由巖藻糖及硫酸酯基團組成的多糖類物質(zhì)，通常結(jié)構(gòu)較為簡單，而且硫酸酯化形式規(guī)律。幾十年來，人們深入研究了褐藻巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)和活性，但對于海參巖藻聚糖硫酸酯生物學(xué)功能的研究甚少且較零散［4］。目前，僅見海參巖藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan，SC-FUC)有免疫調(diào)節(jié)作用［5］和抑制破骨細(xì)胞生成的作用［6］，對其抗腫瘤作用的研究未見報道。

本文選取了從美國肉參(Isostichopus badionotus)中制備的SC-FUC，采用小鼠Lewis肺癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型，對SC-FUC抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用及其機制進行探討，為低值海參的高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料美國肉參干品，購自青島市南山海參市場;C57BL/6J小鼠，♀，SPF 級，17 ～18 g，購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號2007-001;小鼠高轉(zhuǎn)移Lewis肺癌細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞庫，于RPMI 1640培養(yǎng)基中(內(nèi)含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素)，37℃ 、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、每2～3天細(xì)胞傳代1次。

1.1.2藥品和試劑RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Gibco公司產(chǎn)品;注射用環(huán)磷酰胺為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品;小鼠 HPA、HIF-1α、MMP-9、MMP-2、VEGF及β-actin引物，均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;Taq酶、M-MLV，日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器TC-96 Life Pro基因擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品;培清JS-780全自動凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司產(chǎn)品;2711型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司產(chǎn)品;TGL-16G型臺式離心機、WGP-300型隔水恒溫培養(yǎng)箱，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;DL-CJ-1N型超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;SZ-51型解剖鏡，O-lympus公司產(chǎn)品;鍍鉻游標(biāo)卡尺，江西工具廠產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1SC-FUC的制備將美國肉參干品粉碎，于丙酮中浸泡脫脂24 h，室溫下晾干。向干物中(以下提取步驟均按照1 g干物計算)加入30 ml木瓜蛋白酶解液，于60℃水浴下攪拌反應(yīng)24 h，離心。向上清液中加入1.6 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CPC溶液后，棄上清，沉淀溶解于15 ml 3 mol·L－1NaCl∶乙醇(100 ∶15，V/V)溶液中，4℃放置24 h，離心，棄去沉淀。向上清液中繼續(xù)加入20 ml體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇溶液沉淀，所得沉淀用30 ml體積分?jǐn)?shù)為0.8和體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇洗2～3次。去上清，將沉淀干燥，蒸餾水溶解，用截流分子量為6 000 u的中空纖維膜超濾并脫鹽，濃縮，凍干，得到海參粗多糖。

取400 mg海參粗多糖溶于10 ml 25 mmol·L－1NaH2PO4－NaOH(pH 6.3)緩沖鹽溶液中，過DEAE-52陰離子交換柱，采用 0～1.4 mol·L－1NaCl緩沖鹽溶液進行梯度洗脫，流速為0.5 ml·min－1，每10 min收集1管。并通過液相 TSK4000柱子檢測組分單一的管，收集后透析，真空冷凍干燥，得到巖藻聚糖硫酸酯的純品。經(jīng) TSK G4000PWXL色譜柱測定，分子量達(dá)435 ku。PMP柱前衍生法測定單糖組成，單糖僅含有巖藻糖，離子色譜法測定其硫酸基含量約為32.9%。

1.2.2動物模型的建立和實驗收集Lewis肺癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，取0.2 ml(含瘤細(xì)胞1×106)接種于小鼠右腋窩皮下。體內(nèi)傳代10次，無菌條件下取接種10 d的Lewis肺癌實體瘤，按瘤塊(g)∶生理鹽水(ml)為1∶3的比例制成單細(xì)胞懸液，取0.2 ml(含瘤細(xì)胞2×106)接種于C57BL/6J小鼠右腋窩皮下［7］。接種次日，隨機分為模型對照組、陽性對照組(CTX)和SC-FUC低、高劑量組，每組10只。劑量組分別腹腔注射SC-FUC(10和20 mg·kg－1)，陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(20 mg·kg－1)，模型對照組腹腔注射生理鹽水。注射體積為0.2 ml·(10 g·bw)－1，每天1 次，連續(xù)21 d。小鼠于末次給藥后，禁食不禁水12 h，脫頸椎處死，仔細(xì)剝離原位腫瘤，稱重，于冰上取0.1 g腫瘤組織，置液氮中凍存?zhèn)溆?。取雙側(cè)肺，用Bouin's液固定。

1.2.3腫瘤生長曲線荷瘤小鼠接種12 d后，每隔2 d用游標(biāo)卡尺實際測量腫瘤的最大直徑A(cm)和最小直徑B(cm)，按下式計算各組腫瘤體積V(cm3)的大小。腫瘤體積(cm3)=(1/2)AB2，計算各組腫瘤平均體積，繪制腫瘤生長曲線，比較各組小鼠腫瘤的生長情況。

1.2.4腫瘤生長抑制率抑瘤率/%=(1－劑量組平均瘤重/模型對照組平均瘤重)×100%。

1.2.5肺轉(zhuǎn)移抑制率將Bouin's液固定后的雙肺在解剖鏡下計數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)(＞2 mm)，計算:轉(zhuǎn)移抑制率/%=(1－劑量組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)/模型對照組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù))×100%。

1.2.6RT-PCR法檢測腫瘤組織轉(zhuǎn)移相關(guān)基因mRNA的表達(dá)采用TRIzol法提取總RNA，采用兩步法RT-PCR檢測各組小鼠原位腫瘤組織中目的基因HIF-1α、VEGF、HPA、MMP-9 和 MMP-2mRNA 的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，退火 30 s，72℃延伸 45 s，最后 72℃延伸 10 min，不同基因的引物設(shè)計和實驗條件見Tab 1。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并進行條帶的灰度掃描，以β-actin作為內(nèi)參校正，目的基因的相對表達(dá)量用目的基因的灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

Tab 1 The designed primers and reaction condition for detecting different genes

1.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，同時進行LSD兩兩比較，實驗結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1SC-FUC對腫瘤生長曲線的影響由Fig 1可見，接種腫瘤細(xì)胞12 d后，荷瘤小鼠腫瘤體積明顯增大，SC-FUC劑量組小鼠腫瘤體積比模型對照組明顯要小，高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組，環(huán)磷酰胺陽性對照組小鼠腫瘤體積最小，各組小鼠腫瘤體積的增長速度差異具有顯著性。

2.2SC-FUC對荷瘤小鼠原位瘤生長的抑制作用由Tab 2所示，低、高劑量組SC-FUC均能抑制小鼠Lewis肺癌原位腫瘤的生長，其抑瘤率分別為31.4% 和59.7%，以高劑量SC-FUC的效果較好。

Fig 1 Growth curve of tumor in mice(±s，n=10)

2.3SC-FUC對荷瘤小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的影響由Tab 2可見，與模型對照組相比，SC-FUC劑量組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)降低(P＜0.01)，低、高劑量組的轉(zhuǎn)移抑制率分別為54.0%和77.9%。由Fig 2所示，模型對照組雙側(cè)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目較多，且體積較大，而SC-FUC低、高劑量組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目少而且體積小，多分布在單側(cè)。結(jié)果提示，SC-FUC可以抑制Lewis肺癌細(xì)胞小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

Tab 2 Effect of SC-FUC on tumor growth and metastasis of Lewis lung carcinoma cell in mice(±s，n=10)

Tab 2 Effect of SC-FUC on tumor growth and metastasis of Lewis lung carcinoma cell in mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Tumor weight/g Inhibition rate/%Nodule number Inhibition rate/%Model 4.39 ±0.73 0 11.3 ±2.99 0 CTX 1.41 ±1.39＊＊ 69.3 0 100 SC-FUC low 3.02 ±1.84* 31.4 5.2 ±1.57* 54.0 SC-FUC high 1.81 ±0.89＊＊ 59.7 2.5 ±0.71＊＊77.9

Fig 2 Metastatic tumor foci on lung surface in mice

2.4SC-FUC對HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)的影響HIF-1α是缺氧條件下腫瘤組織中廣泛表達(dá)的一種因子，而VEGF作為HIF-1α的靶基因是最重要的促血管生長因子［8］。有研究表明［9］，HIF-1α 和VEGF對腫瘤血管的形成及生長起著至關(guān)重要的作用。PCR結(jié)果表明，模型對照組小鼠腫瘤組織中HIF-1α和 VEGF mRNA高表達(dá)，給予 SC-FUC后，HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)量下降(P＜0.05，P＜0.01)，分別平均下降了33.60%和39.42%(Fig 3)。

2.5 SC-FUC對HPA和MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響腫瘤細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的降解，主要依靠乙酰肝素酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和纖溶酶等［10］。PCR結(jié)果表明，SC-FUC能抑制 HPA、MMP-2和 MMP-9的 mRNA表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，與模型對照組相比，SC-FUC劑量組3者mRNA表達(dá)分別平均減少了12.55%、35.64%和29.91%(Fig 4)。

3 討論

采用Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型，對SCFUC抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用進行了研究，并對其作用機制進行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SC-FUC可以抑制小鼠腫瘤的生長，低、高劑量組的抑瘤率分別為31.4%和59.7%;同時，SC-FUC抑制了腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，抑制率分別為54.0%和77.9%。結(jié)果提示，SC-FUC在小鼠體內(nèi)具有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

硫酸基含量與多糖的活性密切相關(guān)，硫酸化程度高的多糖往往具有良好的生理活性，Kayanagi等［11］研究發(fā)現(xiàn)過硫酸化的褐藻多糖硫酸酯可以增強對腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的抑制作用增強其抗腫瘤活性。Teruya等［12］進一步研究表明，經(jīng)過硫酸化修飾將巖藻聚糖硫酸化程度由13.5%增加到32.8%，可以明顯增強其抗腫瘤活性。美國肉參SC-FUC是一種天然的硫酸多糖，硫酸化程度高，其硫酸根含量為32.9%，由此推測其抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用可能與高硫酸化程度有關(guān)。

Lewis腫瘤細(xì)胞增生過快必然會造成局部組織嚴(yán)重缺氧，處于缺氧狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞仍能不斷增殖和浸潤，其主要原因之一是缺氧引起腫瘤細(xì)胞的一些基因和蛋白的表達(dá)發(fā)生改變，其中起樞紐作用的是轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α。研究證實HIF-1α在人體許多腫瘤中大量表達(dá)，對腫瘤的生長、血管形成、轉(zhuǎn)移及凋亡皆有影響［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)［14］，HIF-1α 不僅使其靶基因VEGF的mRNA穩(wěn)定性增加，而且能增加VEGF的轉(zhuǎn)錄活性。本實驗中，SC-FUC各劑量組中HIF-1α和 VEGF mRNA的表達(dá)均下降(P＜0.05)，并且呈現(xiàn)了較好的相關(guān)性，提示SC-FUC可以通過降低腫瘤組織缺氧條件下HIF-1α及其靶基因VEGF的表達(dá)，抑制血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移。

Fig 3 Effect of SC-FUC on the expressions of HIF-1α and VEGF of tumor in mice(±s，n=10)

Fig 4Effect of SC-FUC on the expression of HPA and MMP-2/9 of tumor in mice(±s，n=10)

ECM的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，主要依靠蛋白水解酶的作用，基質(zhì)金屬蛋白酶是(matrixmetallop roteinases，MMPs)是目前研究最多的。大量的實驗表明，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)MMPs的能力密切相關(guān)［15］。實驗結(jié)果顯示，SC-FUC能降低腫瘤組織中MMP-2/9 mRNA的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞在基質(zhì)中的侵襲和遷移能力。

另有研究表明［16］，乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，HSPG)作為ECM的另一主要成分，其降解也是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。HPA可以降解HSPG，釋放結(jié)合在HSPG上的生長因子，促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Zetser等［17－18］研究發(fā)現(xiàn)，HPA的高表達(dá)可以提高腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，促進血管新生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SC-FUC劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織中HPA的表達(dá)降低，提示SC-FUC通過下調(diào)HPA的表達(dá)，抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和血管新生。

綜上所述，SC-FUC可能是通過抑制在缺氧條件下腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)，抑制其靶基因VEGF的表達(dá)，來達(dá)到抑制腫瘤血管新生的作用。同時，SC-FUC還可以抑制HPA、MMP-2/9的表達(dá)，減少了ECM的降解，降低腫瘤細(xì)胞在ECM中的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。SC-FUC可以抑制Lewis荷瘤小鼠腫瘤的生長和自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，為海參多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)，其結(jié)構(gòu)和作用的關(guān)系還有待進一步研究。

［1］韓 華，易楊華，喇明平，等.糙海參皂苷Scabraside A、B的抗真菌和抗腫瘤活性［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(8):1111－2.

［1］Han H，Yi Y H，La M P，et al.Studies on antifungal and antitumor activities of scabraside A、B from Holothuria scabra Jaeger［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):1111 －2.

［2］胡人杰，于蘇萍，姜 卉，等.刺參酸性粘多糖與可的松聯(lián)用方案對小鼠腫瘤的抑制作用［J］.癌癥，1997，16(6):422－5.

［2］Hu R J，Yu S P，Jiang H，et al.The inhibitory effect of SJAMP combined with cortisone on murine solid tumors［J］.Chin J Cancer，1997，16(6):422 －5.

［3］牛娟娟，宋 楊.刺參黏多糖的生物活性物質(zhì)的研究進展［J］.華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，11(5):651－2.

［3］Niu J J，Song Y.Study on the biological activity of SJAMP［J］.J North China Coal Med Univ，2009，11(5):651 －2.

［4］Mulloy B，Ribeino A，Alves A.Sulfated fucans from echinoderms have a regular tetrasaccharide repeating unit defined by specific patterns of sulfation at the O-2 and O-4 position［J］.J Biol Chem，1994，269(35):22113 －23.

［5］黃益麗，鄭忠輝，蘇文金，等.二色桌片參的化學(xué)成分研究Ⅲ.二色桌片參多糖-1-巖藻聚糖的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.海洋通報，2001，20(1):88－91.

［5］Huang Y L，Zheng Z H，Su W J，et al.Studies on the chemical composition of sea cucumber mensamaria intercedensⅢ.Immunomodulative effects of PMI-1［J］.Mar Sci Bull，2001，20(1):88 －91.

［6］Kariya Y，Mulloy B，Imai K，et al.Isolation and partial characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus and their ability to inhibit osteoclastogenesis［J］.Carbohydr Res，2004，25(2):1339 －46.

［7］徐曉玉，嚴(yán)鵬科，陳 剛，廖端芳.川芎嗪對小鼠肺癌血管生長和VEGF表達(dá)的抑制［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20(2):151－4.

［7］Xu X Y，Yan P K，Chen G，Liao D F.Inhibition of tetramethylpyrazine on Lewis lung carcinomas，microvessel growth and VEGF expression in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(2):151－4.

［8］Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease［J］.Nat Med，2003，9(6):653 －60.

［9］Oh S H，Woo J K，Jin Q，et al.Identification of novel antiangiogenic anticancer activities of deguelin targeting hypoxia-inducible factor-1 alpha［J］.Int J Cancer，2008，122(1):5 － 14.

［10］Starnenkovic I.Extracellular matrix remodeling:the role of matrix metalloproteinases［J］.J Pathol，2003，200(4):448 － 64.

［11］Koyanagi S，Tanigawa N，Nakagawa H，et al.Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities［J］.Biochem Pharmacol，2003，65(2):173 －9.

［12］Teruya T，Konishi T，Uechi S，et al.Anti-proliferative activity of oversulfated fucoidan from commercially cultured Cladosiphon okamuranus TOKIDA in U937 cells［J］.Int J Biol Macromol，2007，41(3):221－6.

［13］孫 軍，李 巖.姜黃素對人肝癌細(xì)胞BEL-7402中HIF-1α表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(11):1379－83.

［13］Sun J，Li Y.Effects of curcumin on expression of HIF-1α in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1379 －83.

［14］Damert A，Machein M，Breier G，et al.Up-regulation of vascular endothelial growth factor exp ression in a rat glioma is conferred by two distinct hypoxia-driven mechanisms［J］.Cancer Res，1997，57(17):3860－4.

［15］Stamenkovic I.Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis［J］.Semin Cancer Biol，2000，10(6):415 －33.

［16］Vlodvas I，Eldor A，Haimovitz Firedman A，et al.Expression of heparanase by platelets and circulating cells of the immune system:Possible involvement in diapedesis and extrvaasation［J］.Invasion Metastasis，1992，12(2):112 －27.

［17］Zetser A，Bashenko Y，Edovitsky E，et al.Heparanase induces vascular endothelial growth factor expression:correlation with p38 phosphorylation levels and Src activation［J］.Cancer Res，2006，66(3):1455－63.

［18］Zetser A，Bashenko Y，Miao H Q，et al.Heparanase affects adhesive and tumorigenic potential of humanglioma cells［J］.Cancer Res，2003，63(22):7733 －41.