石菖蒲α-細(xì)辛醚對Lithium-Pilocarpine癲癇模型GABA系統(tǒng)的調(diào)控作用

苗靜琨，陳啟雄，吳小玫，張曉萍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科，兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地，重慶400014)

在前期研究中我們已經(jīng)證實(shí)石菖蒲α-細(xì)辛醚對多種實(shí)驗(yàn)性癲癇模型具有確切抗癲癇作用，但其作用機(jī)制尚待闡明［1－2］。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)作用的失平衡是癲癇發(fā)生的基本機(jī)制，γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)內(nèi)最具有代表性的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)大約30% ～40%CNS神經(jīng)元的功能，CNS中GABA含量降低是神經(jīng)細(xì)胞過度興奮，誘發(fā)同步放電，產(chǎn)生癲癇發(fā)作的重要原因之一［3］。因此，我們采用Lithium-Pilocarpine模型研究了石菖蒲α-細(xì)辛醚治療對GABA系統(tǒng)的調(diào)控作用，以期從分子水平探討石菖蒲α-細(xì)辛醚抗癲癇作用的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器α-細(xì)辛醚，愛生藥業(yè)(沈陽)有限公司生產(chǎn);Lithium、Pilocarpine購自 Sigma公司;GAD67免疫組化試劑盒、GABAAR原位雜交試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析醇。氨基酸分析儀為日立L-8800氨基酸自動分析儀，紫外分光光度計(jì)為美國Beckman公司DU-7500型。

1.2實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥♂Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所。隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、α-細(xì)辛醚治療組(100 mg·kg－1)等3組。各組又分為癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus，SE)后 12、24、48、72 h及1周等5個(gè)亞組。給予匹羅卡品前60 min，α-細(xì)辛醚治療組給予α-細(xì)辛醚100 mg·kg－1，正常對照組、模型對照組給予同等劑量的生理鹽水。

1.3建立Lithium-Pilocarpine癲癇模型參照Celine Dube方法加以修改［4］。腹腔注射匹羅卡品后，實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)強(qiáng)直－陣攣持續(xù)狀態(tài)，即癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus，SE)。具體方法:腹腔注射氯化鋰 160 mg·kg－1，18 h ～24 h 后，腹腔注射匹羅卡品 40 mg·kg－1，觀察 120 min，出現(xiàn) SE 1 h 后腹腔注射安定4 mg·kg－1，以降低死亡率。凡SE持續(xù)時(shí)間未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)或中途死亡者均從本實(shí)驗(yàn)中排除。1.4海馬組織GABA含量測定分別于SE后12、24、48、72 h及1周等時(shí)相處死實(shí)驗(yàn)大鼠各10只，取雙側(cè)腦組織，冰盤上分離海馬，放入組織勻漿器內(nèi)，按50 mg wwt·ml－1比例加入冰冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磺基水楊酸，充分研磨，制成質(zhì)量濃度為5 g·L－1的組織勻漿，4℃，20 000 r·min－1冷凍離心10 min，分離上清，采用日立L-8800氨基酸自動分析儀檢測GABA含量。

1.5谷氨酸脫羧酶(GAD67)免疫組織化學(xué)檢測分別于SE后各時(shí)相，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉50 mg·kg－1，麻醉后暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈，快速灌注PBS 250 ml，隨后灌注質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛/0.1 MPBS液500 ml進(jìn)行內(nèi)固定，分別取前囟前2.0至4.0 mm處含額葉及前囟后4.0至6.0 mm處含海馬的腦組織，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖液中過夜，次日做冠狀冰凍切片，厚度為8～10 μm，室溫放置30 min后，入4℃丙酮固定10 min，PBS洗5 min×3次備檢。以常規(guī)SP法進(jìn)行免疫組化檢測，聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察。以PBS取代一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷:細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核呈棕黃色為GAD67陽性反應(yīng)。以Tiger920圖像分析系統(tǒng)檢測切片陽性平均光密度(Average optical density，AOD)。每只大鼠取切片3張，在統(tǒng)一放大倍數(shù)(×100)及同一光強(qiáng)度下分析額葉、海馬CA1、CA3區(qū)陽性平均光密度。

1.6γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)活性的檢測分別于SE后各時(shí)相處死實(shí)驗(yàn)大鼠各10只，分離雙側(cè)海馬及額葉組織，放入組織勻漿器中，加入10倍冰冷的勻漿緩沖液充分勻漿后 8 000 r·min－1，4℃離心15 min，收集上清液，取勻漿上清樣品30 μl，另以勻漿緩沖液30 μl設(shè)立對照，加入570 μl pH 8.75的焦磷酸鈉緩沖液，30℃保溫15 min，紫外分光光度計(jì)340 nm比色測吸光度。

1.7GABAAR-mRNA原位雜交檢測分別于SE后各時(shí)相，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉50 mg·kg－1，成功麻醉后立即分離腦組織，液氮過夜，次日做冠狀冰凍切片，厚度8～10 μm，入4℃含1/1 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛/0.1 MPBS中，室溫固定20 min，0.02 mol·L－1PBS(pH 7.2，Rnase free)漂洗5min×3次，體積分?jǐn)?shù)為0.3的H2O21份+甲醇50份混合，室溫孵育30 min，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，室溫消化10 s，用含有1/1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛/0.1 MPBS室溫固定10 min，每張切片加預(yù)雜交液20 μl，恒溫箱內(nèi)(38～42)℃孵育2 h，每切片加雜交液(探針)20 μl，恒溫箱內(nèi)(38 ～42)℃孵育過夜，滴加封閉液，37℃孵育30 min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗體，37℃ 孵育 60 min，滴加 SABC，37℃ 孵育 30 min，滴加生物素化過氧化物酶，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察。以PBS取代探針作為陰性對照。結(jié)果判斷及圖像分析同前。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)方差齊性與否分別用參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)，方差齊性資料單因素多均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，非齊性資料采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1石菖蒲α-細(xì)辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型海馬GABA含量的影響模型組大鼠SE后各時(shí)相海馬GABA含量均明顯降低，且持續(xù)至SE后72 h，之后緩慢增高，至SE后1周接近正常水平，與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。石菖蒲α-細(xì)辛醚治療能明顯增加大鼠SE后各時(shí)相海馬GABA含量(P＜0.05)，表明石菖蒲α-細(xì)辛醚可通過明顯增加海馬GABA含量，從而發(fā)揮抗癲癇作用，見 Tab 1。

Tab 1 GABA content in Hippocampus of the Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(nmol·g－1wet tissue，n=10)

2.2石菖蒲α-細(xì)辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型GAD67表達(dá)的影響模型組大鼠SE后12 h～72 h海馬及額葉GAD67的表達(dá)較正常對照組明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)，其中以SE后12 h GAD67的表達(dá)下降最為明顯，SE后1周，海馬及額葉GAD67的表達(dá)逐漸增加，并接近正常水平。而石菖蒲α-細(xì)辛醚治療組大鼠各時(shí)相腦內(nèi)GAD67表達(dá)增強(qiáng)，并持續(xù)數(shù)日以上。在SE后12 h～72 h，石菖蒲α-細(xì)辛醚治療組海馬及額葉GAD67表達(dá)均明顯高于模型組大鼠 (P＜0.05)。石菖蒲α-細(xì)辛醚能增加腦內(nèi)GAD67表達(dá)以增加GABA合成，提高腦內(nèi)GABA含量，從而發(fā)揮抗癲癇作用，見Tab 2。

2.3石菖蒲α-細(xì)辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型大鼠γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)活性的影響模型組大鼠SE后各時(shí)相腦內(nèi)存在極高的GABA-T活性，與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05);以海馬區(qū)的GABA-T活性增高最為突出。石菖蒲α-細(xì)辛醚治療使大鼠腦內(nèi)GABA-T活性在SE后各時(shí)相點(diǎn)均有明顯而持續(xù)降低(P＜0.05)，有助提高腦內(nèi)GABA含量，控制癲癇發(fā)作;通過腦區(qū)間比較，石菖蒲使海馬區(qū)GABA-T活性的下調(diào)作用明顯強(qiáng)于額葉，差異有顯著性(P＜0.05)，見Tab 3。

2.4石菖蒲α-細(xì)辛醚治療對Lithium-Pilocarpine模型GABAAR-mRNA表達(dá)的影響模型組大鼠SE后12 h～24 h腦內(nèi)GABAAR-mRNA表達(dá)明顯降低，與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。模型組大鼠腦內(nèi)GABAAR-mRNA表達(dá)高峰主要發(fā)生在SE后48 h～72 h;海馬區(qū)GABAAR-mRNA表達(dá)持續(xù)高于額葉 (P＜0.05);石菖蒲α-細(xì)辛醚能明顯增強(qiáng)SE后各時(shí)相點(diǎn)大鼠海馬與額葉GABAAR-mRNA表達(dá)(P＜0.05)，見Tab 4。

3 討論

Lithium-Pilocarpine模型是目前應(yīng)用最多的癲癇模型之一，該模型SE所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元丟失、苔蘚纖維絲狀芽生，以及突觸重建正是癲癇自發(fā)性發(fā)作的組織病理學(xué)基礎(chǔ)［6］。實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)改變與腦電圖異常放電同步，模型建立后能維持較長時(shí)間的反復(fù)癲癇發(fā)作，因而被認(rèn)為是當(dāng)前研究癲癇較實(shí)用的一種動物模型［7］。

Tab 2 AOD of GAD67 immunoreactivity in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(ODu/mm2，n=10)

GABA是CNS內(nèi)最具有代表性的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，一般認(rèn)為CNS中GABA含量降低是神經(jīng)細(xì)胞過度興奮，誘發(fā)同步放電，產(chǎn)生癲癇發(fā)作的重要原因之一［3，5］。GABA 是由腦內(nèi)谷氨酸經(jīng) GAD 脫羧而成，GAD是GABA合成的限速酶，直接影響腦組織中GABA含量，在腦組織中的分布與GABA能神經(jīng)元基本一致，被視為GABA能神經(jīng)元的直接標(biāo)志物［8］。GABA分解代謝首先由 GABA-T將氨基除去、生成琥珀酸半醛(SSA)，后者再經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶氧化成琥珀酸，參與三羧酸循環(huán)，GABA-T是催化GABA生成SSA的關(guān)鍵酶，其活性高低直接影響到GABA的水平［9］。GABA通過GABA受體發(fā)揮抑制性作用，GABAA受體與癲癇關(guān)系最為密切，興奮GABAA受體能抑制癲癇發(fā)作，抑制GABAA受體則會誘發(fā)癲癇［10］。

Tab 3 GABA-T activity in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(nmol·mg－1Pro·min，n=10)

Tab 4 AOD of GABAA-RNA in brain of Lithium-Pilocarpine models after treated with alpha-asarone(ODu/mm2，n=10)

在前期研究中我們已經(jīng)證實(shí)石菖蒲α-細(xì)辛醚在Lithium-Pilocarpine實(shí)驗(yàn)大鼠模型中具有確切抗癲癇作用［1］。本研究中我們通過觀察Lithium-Pilocarpine模型大鼠GABA含量、GAD67表達(dá)、GABA-T活性及GABAA受體表達(dá)的動態(tài)變化及α-細(xì)辛醚治療的影響，探討α-細(xì)辛醚抗癲癇作用的可能機(jī)制。結(jié)果表明，模型大鼠SE后各時(shí)相海馬GABA含量均明顯降低，且持續(xù)至SE后72 h，之后緩慢增高，至SE后1周始接近正常，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)，證實(shí)CNS中GABA介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)功能減弱在癲癇發(fā)生中起著重要作用;SE后12 h～72 h海馬GAD67表達(dá)較對照組明顯降低(P＜0.05)，其中以SE后12 h GAD67表達(dá)下降最為明顯;SE后各時(shí)相腦內(nèi)存在極高的GABA-T活性，表明GABA-T活性增高，可能是Lithium-Pilocarpine模型腦內(nèi)GABA含量降低的重要原因之一;SE后12 h～24 h腦內(nèi)GABAAR-mRNA表達(dá)降低，差異有顯著性(P＜0.05)。GABAAR-mRNA表達(dá)高峰主要發(fā)生在SE后48 h～72 h，此與SE后腦內(nèi)GABA含量逐步回升，抑制性遞質(zhì)系統(tǒng)功能漸有增強(qiáng)的步伐一致。

石菖蒲α-細(xì)辛醚治療能明顯增加Lithium-Pilocarpine模型大鼠SE后各時(shí)相海馬GABA含量(P＜0.05);能增強(qiáng)SE后各時(shí)相腦內(nèi)GAD67表達(dá)(P＜0.05)，并持續(xù)數(shù)日以上;能明顯而持續(xù)地降低SE后各時(shí)相點(diǎn)增高的GABA-T活性，進(jìn)一步抑制GABA分解代謝，從而上調(diào)CNS內(nèi)GABA含量;能明顯增強(qiáng)SE后各時(shí)相點(diǎn)大鼠海馬與額葉GABAAR-mRNA表達(dá)(P＜0.05)。

綜上所述，我們認(rèn)為在Lithium-Pilocarpine誘導(dǎo)的癲癇大鼠中，海馬GABA系統(tǒng)的抑制功能減弱是癲癇產(chǎn)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。石菖蒲α-細(xì)辛醚可能通過抑制GABA-T活性以降低GABA分解代謝，上調(diào)GAD67表達(dá)使GABA合成增加，上調(diào)GABAA受體表達(dá)以增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的抑制功能從而發(fā)揮抗癲癇作用。今后需要進(jìn)一步研究石菖蒲α-細(xì)辛醚對Lithium-Pilocarpine模型慢性期GABA系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，以期能更準(zhǔn)確揭示其可能的機(jī)制。

(致謝:感謝重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院中醫(yī)科張茂教授在本研究中給予的技術(shù)支持和幫助。)

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