AFLP技術(shù)在番茄品種鑒定中的應(yīng)用

劉淑君，楊悅儉，葉青靜，王榮青

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

傳統(tǒng)的番茄品種鑒定有形態(tài)學(xué)［1］、細(xì)胞學(xué)［2］及同工酶法［3］等，但其結(jié)果易受環(huán)境條件影響，或因多態(tài)性低，使應(yīng)用范圍受到限制，對于基因型的準(zhǔn)確鑒定更為困難。DNA分子標(biāo)記為蔬菜品種鑒定開辟了嶄新的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，它有助于直接從分子水平上了解蔬菜品種間的差異，使育種過程更直觀，目的性更強(qiáng)，對于選擇合適的雜交組合以保持或獲得更好的重組優(yōu)良品種顯得極為有效與準(zhǔn)確。其中，AFLP (amplified fragment length polymor-phism)是在RAPD和RFLP標(biāo)記系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種分子標(biāo)記技術(shù)［4］，具有可同時對多位點進(jìn)行檢測、重復(fù)性好、信息量大、符合孟德爾遺傳的特點，非常適合品種多樣性檢測和品種鑒定。本研究利用 AFLP技術(shù)對12個番茄品種材料進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，并以篩選的6對引物的擴(kuò)增結(jié)果為依據(jù)，建立番茄品種鑒定方法，以期為生產(chǎn)上番茄品種的判斷提供新的科學(xué)方法?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的番茄品種 (育種材料)共 20個:9179、198、07-020、07-021、07-025、07-026、07-027、07-029、9818、浙粉 208、浙粉 202、浙雜203、浙雜 210、浙雜 2218、浙雜 2102、浙雜6299、浙雜 2346、浙雜 1802、浙雜 205、以色列189(表 1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

所有番茄材料播于15孔的育苗穴盤中，育苗基質(zhì)采用草炭、蛭石體積比2∶1，待番茄幼苗長出2片子葉時，提取子葉DNA進(jìn)行分析。

DNA提取參照姚金曉等［5］的CTAB小量提取方法，并進(jìn)行改良。1.5 mL離心管加入新鮮葉片0.01 g;加入250 μL CTAB緩沖液 (100 mL 1 mol·L-1TRIS pH 7.5，140 mL 5 mol·L-1NaCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA pH 8.0，740 mL MiliQ H2O，20 g CTAB)，用尖頭玻棒輕輕研磨，然后再加入250 μL CTAB混勻;65℃水浴1 h;置于4℃冰箱或室溫冷卻至15℃以下;加入250 μL 24∶1氯仿/異戊醇，上下混勻5 min，保證樣品與氯仿充分混和;12 000 r·min-1離心10 min;取上清液 200 μL，加入預(yù)先加好200 μL異丙醇的1.5 mL離心管中，輕輕上下顛倒混勻;4℃冰箱靜置30 min以上;10 000～12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液;吹干DNA，讓異丙醇揮發(fā)干凈;加入 100 μL ddH2O(含1 μL 10 mg·mL-1的RNase)溶解DNA;37℃水浴或室溫1 h去除RNA;然后用1%的瓊脂糖電泳檢測。提取的DNA貯備在-20℃的冰箱中備用。

1.2.2 AFLP分析

參照Vos等［6-7］方法，并進(jìn)行了改良。

1.2.3 模板DNA酶切及連接

表1 供試20份番茄育種材料 (或品種)的名稱、來源及主要特性

每個反應(yīng)總體積為 25 μL，其中包括:DNA 250 ng，Eco R I 1.25 U(10 U·μL-1)和Mse I 2.5 U(10 U·μL-1)，Eco R I adaptor 0.5 μL(5 pmol·μL-1)，Mse I adaptor 0.5 μL(5 pmol·μL-1)，ATP 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10 ×buffer(with BSA)5 μL，T4 DNA Ligase 1 U(5 U·μL-1)，ddH2O 15.425 μL，混勻后37℃水浴3 h以上。

1.2.4 DNA片段預(yù)擴(kuò)增

取2.5 μL連接酶切后 DNA模板，加入22.5 μL的預(yù)擴(kuò)增混合液:Eco R I引物0.7 μL(50 ng·μL-1)和 Mse I引物0.7 μL(50 ng ·μL-1)，dNTPs 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10 ×反 應(yīng) 緩 沖 液 2.5 μL(100 mmol·L-1Tris-HCl［pH 9.0］，80 mmol· L-1(NH4)2SO4，100 mmol·L-1KCl，NP-40)，Mg2+2 μL(25 mmol·L-1)，Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1)，無菌純水15.9 μL。混勻后，按如下PCR程序擴(kuò)增:94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共21個循環(huán)。取5 μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖上電泳，用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯示。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20～50倍，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 選擇性AFLP擴(kuò)增

取2.5 μL稀釋后的預(yù)擴(kuò)增混合液，加入17.5 μL選擇性擴(kuò)增混合液:Eco R I選擇性擴(kuò)增引物0.1 μL(50 ng·μL-1)和Mse I選擇性擴(kuò)增引物0.6 μL(50 ng ·μL-1)，dNTPs 0.4 μL(10 mmol·L-1)，10 × 反應(yīng)緩沖液2 μL(100 mmol·L-1Tris-HCl［pH 9.0］，80 mmol·L-1(NH4)2SO4，100 mmol·L-1KCl，NP-40)，Mg2+1.6 μL(25 mmol·L-1)，Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1)，無菌純水12.6 μL?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴(kuò)增:94℃預(yù)變性2 min后;94℃變性30 s，64℃復(fù)性 (每循環(huán)降低0.7℃)30 s，72℃延伸1 min，12個循環(huán)后;94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，28個循環(huán);最后72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后向選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98%甲酰胺，10 mmol·L-1EDTA［pH 8.0］，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯腈)，98℃變性6 min，立即置于冰上冷卻，待用。

1.2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺電泳分析

經(jīng)預(yù)電泳 (40 W恒功率)30 min后，取5 μL上樣混合物于6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分析 (40 W恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶位于同一預(yù)定位置時終止。

1.2.7 銀染成像

按照 Ceatano-Anolles等［8］的方法染色。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)各番茄品種基因組DNA的AFLP標(biāo)記檢測結(jié)果，選取清晰可辨的擴(kuò)增條帶用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。分別以1和0代表在某一遷移率處有或無擴(kuò)增片斷 (譜帶)出現(xiàn)，將獲得的AFLP指紋圖譜轉(zhuǎn)換為1和0構(gòu)成的數(shù)字矩陣，計算各品種中出現(xiàn)的所有遷移率不同的擴(kuò)增譜帶數(shù)目、多態(tài)性譜帶數(shù)目及其比例、品種間的共有譜帶率等的各項參數(shù)。其中共有譜帶率 (BS-Band Sharing)的計算公式［9］為:BS=2 Nab/(Na+Nb)，公式中Nab表示A與 B 2個品種的共同譜帶數(shù)，Na、Nb則分別表示 A與 B 2個品種各自的總譜帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP技術(shù)效果

實驗通過對引物的篩選，初步篩選出6對AFLP選擇性引物，并對8個番茄材料及4個番茄品種進(jìn)行AFLP分析，都得到了清晰的指紋，并且所有的材料均表現(xiàn)出多態(tài)性，這可從引物組合EACA/M-CTA的指紋 (圖1)情況看出。

圖1 12個番茄材料的AFLP指紋圖譜

6對引物的擴(kuò)增結(jié)果 (表2)顯示:共擴(kuò)增了130條帶，平均每對引物擴(kuò)增21.2條帶，其中有多態(tài)性條帶80條，平均每對引物擴(kuò)增多態(tài)性帶13.3條，多態(tài)性比例62%。不同引物組合揭示多態(tài)性的能力有差別。引物E-ACC/M-CTG擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最少，為8條，對供試番茄材料的區(qū)分率為50%;而E-ACA/M-CTA擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最多，為24條，多態(tài)性比例高達(dá)75%，對供試番茄材料的區(qū)分率為100%。

2.2 AFLP指紋分析

2.2.1 8個番茄材料的分析

表2 6對AFLP引物對12個番茄材料的擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)6對引物的指紋情況，隨機(jī)選擇了8個番茄材料18對組合進(jìn)行比較。18對番茄材料間的共有譜帶率 (BS)分析結(jié)果 (表3)表明，這些番茄材料間的BS大小的變化范圍為54%～93%，平均為82%。根據(jù)以往的報道，BS值越大則其遺傳關(guān)系越近，而BS值越小則遺傳關(guān)系越遠(yuǎn)，進(jìn)行遺傳改良的潛力越大，遺傳差異大的品種更適于作為育種親本材料。實驗結(jié)果證明了AFLP篩選番茄親本的有效性。

表3 8個番茄材料間的共有譜帶率

2.2.2 指紋圖譜構(gòu)建與品種鑒定

以應(yīng)用 E-ACG/M-CTG、E-ACG/M-CAT和 EACA/M-CTA引物構(gòu)建的6個番茄品種的AFLP指紋圖譜 (圖2)為例，3對引物共擴(kuò)增出45條帶，其中多態(tài)性帶18條，占40%，對6個番茄品種的區(qū)分率達(dá)100%，可成為AFLP技術(shù)鑒定這些番茄品種的依據(jù)。

圖2 6個番茄材料的AFLP指紋圖譜

研究還發(fā)現(xiàn)，一些擴(kuò)增帶僅在部分番茄品種中出現(xiàn)，例如圖2條帶 b、c、d與 h只出現(xiàn)在9179中，一旦這些條帶被確認(rèn)具有品種的特異性，即可通過特征指紋快速鑒別番茄品種，從而大大提高鑒定效率。

3 小結(jié)與討論

DNA分子標(biāo)記是基因型在DNA水平上的表現(xiàn)形式，代表著品種間本質(zhì)的差異，是繼形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標(biāo)記。為加快DNA分子標(biāo)記技術(shù)在番茄育種實踐中的應(yīng)用，提高育種水平，人們已成功地將RAPD［9-10］(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA)、SSR(簡單序列重復(fù))［11］及 AFLP技術(shù)應(yīng)用于番茄的遺傳關(guān)系［12］、品種鑒定［13］等方面的研究。

利用分子標(biāo)記可以確定親本之間的遺傳差異和親緣關(guān)系，指導(dǎo)雜交育種親本選配［14］，減少雜交組合數(shù)［15］，有效劃分雜種優(yōu)勢群［16］，為提高育種效率提供有效手段。通過親緣關(guān)系分析，可以糾正形態(tài)分類中一些不恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論以及目前育種工作中存在的一些問題。本研究的初步分析結(jié)果表明，不同番茄材料間AFLP指紋的BS值存在明顯的差異，因此可以利用DNA指紋計算個體或品種間的BS值，以此估計它們之間的遺傳距離，作為育種親本選擇的參考。

用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩(wěn)定可靠且多態(tài)性豐富的優(yōu)點，非常適合于品種鑒定等方面的應(yīng)用。本研究采用6對引物對6個番茄品種進(jìn)行的AFLP分析，能夠產(chǎn)生較為豐富的多態(tài)性以及穩(wěn)定的AFLP標(biāo)記，可區(qū)分6個番茄品種，并可作為6個番茄品種鑒定的依據(jù)。本研究建立的是一個利用DNA指紋來進(jìn)行番茄品種鑒定的模型，雖然僅研究了6個番茄品種，然而研究的品種數(shù)量是可以增加的，而且隨著品種和所用引物數(shù)量的增加，得到的結(jié)果會更準(zhǔn)確。利用本研究建立的方法可以為保護(hù)番茄育種產(chǎn)權(quán)、登錄新品種、鑒定和檢測苗木真實性和純度等提供客觀、科學(xué)和準(zhǔn)確的技術(shù)保障。

［1］ 蔣慧萍，李楊瑞.利用同工酶、RAPD技術(shù)及形態(tài)學(xué)標(biāo)記對不同地域木豆品種的遺傳多樣性研究 ［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，23(2):483-486.

［2］ 蔡華，馬傳喜，喬玉強(qiáng).小麥 ×玉米誘導(dǎo)小麥單倍體的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)鑒定 ［J］.核農(nóng)學(xué)報，2008，22(2):127-130.

［3］ 文方德，李卓杰，傅家瑞.用ACP及ADH同工酶等電聚焦快速鑒定番茄雜種純度 ［J］.園藝學(xué)報，1996，23(2):202-204.

［4］ 姚祝平，葉青靜，楊悅儉，等.番茄種質(zhì)遺傳多樣性的AFLP分 析 ［J］.浙 江 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報，2010，22(2):156-160.

［5］ 姚金曉，楊悅儉.幾個番茄品種 AFLP指紋圖譜的建立［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21(5):424-428.

［6］ Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP:A new technique for DNA fingerprinting ［J］.Nucleic Acid Research，1995，23(21):4407-4414.

［7］ 李大志，鄧子牛 應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù)分離應(yīng)答B(yǎng)ABA誘導(dǎo)的番茄抗病相關(guān)基因 ［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，33(1):32-36.

［8］ Caetano-Anolles G，Bassam B J，Gresshoff P M.DNA silver staining［J］.Biotechnological Advance，1997，15(1):175.

［9］ Dunnington E A，Gal O，Siegel P B，et al.Deoxyribonucleic acid fingerprint comparisons between selected populations of chickens ［J］.Poultry Science，1991，70(3):463-467.

［10］ 高藍(lán)，李浩明.利用RAPD標(biāo)記分析番茄雜種遺傳純度［J］.分子植物育種，2006，4(3):385-39 l.

［11］ Suliman-Pollatschek S， Kashkush K， Shats H， et al.Generation and mapping of AFLP，SSRs and SNPs in Lycopersicon esculentum ［J］.Cellular and Molecular Biology Letters，2002，7(2):583-597.

［12］ 江建銘，沈宇峰，孫乙銘.利用 AFLP分子標(biāo)記分析夏枯草種質(zhì)資源遺傳多樣性 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21(1):16-19.

［13］ 文亞峰，何剛，張江.棗優(yōu)良品種分子鑒別系統(tǒng)的開發(fā)［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2007，27(6):119-121.

［14］ 石勝友，成明昊，胡玉林，等.用AFLP分析小金海棠的起源 ［J］.園藝學(xué)報，2008，35(2):281-284.

［15］ 高藍(lán)，李浩明.利用RAPD標(biāo)記分析番茄雜種遺傳純度［J］.分子植物育種，2006，4(3):385-391.

［16］ 王日升，李楊瑞，黃偉雄，等.微衛(wèi)星DNA分析番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系 ［J］.西北植物學(xué)報，2005，25(12):2426-2430.