脂聯(lián)素基因突變-11377C/G檢測方法建立及與2型糖尿病關(guān)系的研究

裴 林,喬博明,賈 玫*,張 旗

(北京大學(xué)人民醫(yī)院 1.檢驗科;2.中心實驗室,北京100044)

脂聯(lián)素(adiponectin,APN)是新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子,與肥胖、胰島素抵抗(IR)、2型糖尿病(T2DM)等疾病密切相關(guān)[1-3]。編碼人脂聯(lián)素的基因為aPM1,位于染色體3q27,由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。全基因組寬帶掃描顯示該區(qū)域存在T2DM和代謝綜合征的易感位點[4-7],提示aPM1多態(tài)性與T2DM可能存在相關(guān)性。目前,已發(fā)現(xiàn)10余個脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點及一些罕見的錯義突變。有研究認(rèn)為,啟動子區(qū)域的SNPs、SNP+45及SNP+276和部分錯義突變與2型糖尿病和(或)胰島素抵抗存在相關(guān)關(guān)系,這種相關(guān)性主要由于突變影響了脂聯(lián)素的表達(dá)水平及其功能。

近年來國外研究發(fā)現(xiàn)aPM1啟動子區(qū)域存在-11377C/G多態(tài)性,并證實該多態(tài)性與肥胖、胰島素抵抗和T2DM有關(guān)。本研究旨在建立ARMS-TaqMan檢測aPM1-11377C/G多態(tài)性方法并探討血清脂聯(lián)素水平及aPM1-11377C/G多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 對象

來源于2009年1月至2009年12月我院內(nèi)分泌科住院患者及我院健康體檢者。分為糖尿病組(T2DM)和對照組(NC)。 ①T2DM 組:156人(男87/女69),依照1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。②NC組:89例(男21/女 68),空腹血糖(FBG)＜6.1 mmol/L,無糖尿病史。

1.2 方法

1.2.1 測定身高、體重、計算體重指數(shù),測定腰圍、臀圍,計算腰臀比。

1.2.2 血液生化指標(biāo)的測定 血清脂聯(lián)素水平檢測方法為ELISA法,由美國RD system公司提供?？崭挂葝u素(FINS)和餐后2 h胰島素(PINS)測定使用羅氏2010型電化學(xué)發(fā)光儀,所用試劑由羅氏公司提供。總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋

白膽固醇(LDL-C)測定使用日立7170全自動生化分析儀,所用試劑由日本和光公司提供。HbA1C測定使用高壓液相親和層析法,所用試劑由美國Primus公司提供。

1.2.3 人全血標(biāo)本基因組DNA的提取 采用日本東洋紡(TOYOBO)磁珠法提取,采用EDTA-K2抗凝新鮮全血標(biāo)本,提取基因組DNA標(biāo)本-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 人aPM1-11377C/G點突變不同基因型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的獲取 等位基因野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品:上游引物 5′AGAACCGGCTCAGATCCTGTC3′;下游引物 5′GTGTGGGGCTTGGCAAGTTAA3′(上海生工)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGM-T載體(北京天根)連接后轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌進(jìn)行克隆,提取質(zhì)粒經(jīng)測序確定后作為等位基因野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。等位基因突變型質(zhì)粒 標(biāo) 準(zhǔn) 品:上 游 引 物 5′AGAACCGGCTCAGATCCTGTG3′;下 游 引 物 5′AGCAGCCTGGAGAACTGGAAG3′,其余同上。等位基因雜合型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品:將等量野生型和純合突變型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合作為等位基因雜合型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。對不同基因型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品配制成5×107copies/ml,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物及TaqMan探針設(shè)計 引物設(shè)計采用Primer Premier5.0軟件,由上海生工合成,北京賽百盛合成TaqMan探針。-11377C/G點突變擴(kuò)增片段長度139 bp,野生和突變上游引物3′端-2位引入錯配堿基”T”(正配堿基應(yīng)為”C”)。TaqMan探針與上游引物擴(kuò)增的模板鏈互補。TaqMan探針5′端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)FAM,3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)TAMRA(表1)。

表1 ARMS-TaqMan方法檢測aPM1基因C-11377G點突變引物及探針序列表

1.2.6 ARMS-TaqMan方法反應(yīng)體系及測定條件反應(yīng)體系 25 μ l,包括 2.5 ×RealMasterMix 10 μ l,上 、下游引物各 0.4 μ M,TaqMan prob 0.8 μ M,模板 2.5 μ l,使用 BIO-RAD Opticon 2熒光定量PCR儀檢測TaqMan探針FAM熒光信號。反應(yīng)條件94℃10 min,94℃30 sec,60℃60 sec,40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組間生化指標(biāo)比較 見表2。

表2 T2DM組和對照組間基本資料比較(x—±s)

2.2 基因型分組臨床資料比較 見表3。

表3 基因型分組臨床資料比較(x—±s)

2.3 aPM1-11377C/G點突變CC、CG、GG 三種基因型APN水平比較 245例調(diào)查對象中,共檢測到GG、CG、CC 基因型分別為11例 、88例和 146例,單因素方差分析顯示,從CC、CG、GG基因型的APN水平呈趨勢性降低(9.72±5.52 mg/L,6.86±4.00 mg/L,4.29±2.18 mg/L,P＜0.001)。

2.4 ARMS-TaqMan方法檢測aPM1-11377C/G點突變 見圖1。分別顯示不同質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在5×107copies/ml濃度時不同引物對不同基因型的循環(huán)閾值(CT值)變化情況。由圖中可見,根據(jù)有無指數(shù)擴(kuò)增期及CT值,可明確將CC、CG、GG三種基因型進(jìn)行區(qū)分。

2.5 T2DM組和對照組aPM1-11377C/G基因型及等位基因頻率比較 見表4。

圖1 aPM1-11377 C/G點突變不同等位基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品型熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖(5×107copies/ml)

表4 T2DM組和對照組aPM1-11377C/G基因型及等位基因頻率比較

3 討論

目前檢測SNP的方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、限制性片段長度多態(tài)性分析(PCRRFLP)和變性高效液相色譜分析(DHPLC)等,但PCR-SSCP重復(fù)性較差;PCR-RFLP只能對含有酶切位點的SNP進(jìn)行分型,而aPM1在-11377位點附近無酶切位點;DHPLC不能確定SNP的位置和類型,且只能檢測雜合突變,故本研究未選用上述方法。

ARMS-PCR的測定原理是基于錯配出現(xiàn)在引物3′端時,引物將不能延伸。為了增加擴(kuò)增特異性,本研究還在引物3′端-2位引入了錯配堿基T。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序確定,準(zhǔn)確性和特異性均較高。本研究通過對野生型和突變型基因進(jìn)行質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化、增菌、提取質(zhì)粒、測序確定等步驟,獲得了 aPM1-11377C/G野生型和突變型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,為進(jìn)一步檢測臨床標(biāo)本提供了質(zhì)量保證。

本研究所用ARMS-TaqMan PCR技術(shù),通過對引物3′端正配與錯配的擴(kuò)增效率差異的比較鑒定SNP,且可以定量檢測。該技術(shù)準(zhǔn)確度高,適合樣本多、位點數(shù)量少的檢測。采用本方法檢測 aPM1 SNP,國內(nèi)尚無人采用。與上述方法比較,該方法靈敏、簡便,重復(fù)性好,交叉污染少,易于自動化,由于本研究獲得了人aPM1-11377C/G點突變不同基因型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,故可應(yīng)用于臨床,為今后的定量檢測奠定了基礎(chǔ)。

本文研究顯示aPM1-11377C/G突變對糖脂代謝均有影響,T2DM組血清脂聯(lián)素水平低于對照組(P=0.019),與 Weyer、Pellme 和 Daimon[9-11]的研究結(jié)果相符。而Looker等[12]在對有T2DM的Pima印地安人所做的研究表明,在血糖調(diào)節(jié)受損或糖尿病病程＜10年的患者中最低,在糖耐量正?；蛱悄虿〔〕讨辽?0年的患者中最高,提示T2DM患者血清脂聯(lián)素水平與病程相關(guān),而病程大于10年的患者血清脂聯(lián)素水平不降反升,可能與糖尿病腎臟損害,引起腎小球濾過率下降,進(jìn)而引起脂聯(lián)素排泄障礙有關(guān),具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示aPM1-11377C/G基因多態(tài)性與T2DM發(fā)生相關(guān),G等位基因頻率百分比與T2DM呈正相關(guān)。對照組和T2DM組apM1-11377C/G基因多態(tài)性發(fā)生頻率分別為19.11%和24.36%,該頻率與日本人報道一致[13],與德國人[14]和瑞士高加索人[15]不同,說明該位點存在一定的種族差異性。

綜上所述,aPM1-11377C/G多態(tài)性及血清脂聯(lián)素水平與T2DM存在一定的相關(guān)性。本研究通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的獲得、ARMS-TaqMan PCR檢測 aPM1-11377C/G多態(tài)性方法的建立,對臨床檢測aPM1-11377C/G多態(tài)性,預(yù)測T2DM提供了初步的科學(xué)依據(jù)。本研究與國內(nèi)外大量研究皆表明脂聯(lián)素在肥胖、T2DM、心血管疾病患者血中水平下降,脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞因子中唯一一個在病理狀態(tài)下濃度降低的因子,提示我們今后可能通過補充脂聯(lián)素來作為治療T2DM的方法之一,因此本研究對于T2DM患者今后的用藥提供了初步的科學(xué)依據(jù)。

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