LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中甘草次酸及其臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究

張 軍，陳 玟，居文政，劉 芳，鄒 沖

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇南京 210029)

甘草酸二銨(Diammonium glycyrrhizinate)是中藥甘草有效成分提取物甘草酸的銨鹽，有較強(qiáng)的抗炎、保護(hù)肝功能作用，作為治療肝炎的有效藥物廣泛應(yīng)用于臨床。甘草酸在體內(nèi)代謝為甘草次酸而發(fā)揮作用，這一轉(zhuǎn)化依賴腸道正常菌群水解，且進(jìn)行緩慢［1-2］。甘草次酸血濃度 HPLC［8］、LC-MS 測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道［3-4，6］，但由于體內(nèi)代謝物復(fù)雜，方法選擇性差;文獻(xiàn)［5］雖采用LC-MS/MS法測(cè)定甘草次酸血濃度，但其提取方法采用固相萃取，檢測(cè)成本高，且檢測(cè)方法的靈敏度不適合人體甘草酸治療劑量的藥代動(dòng)力學(xué)研究。本研究采用LC-MS/MS方法測(cè)定甘草二酸銨膠囊口服給藥人血漿中甘草次酸濃度，旨在建立簡(jiǎn)單、可靠、靈敏的甘草次酸分析測(cè)定方法，并用于甘草酸二銨口服給藥的人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑草酸二銨膠囊(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):080907，規(guī)格:50 mg/粒);甘草次酸對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào):110731-200615);潑尼松龍對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào):100153-199603);甲醇、乙腈、乙酸為色譜純;乙酸銨為分析純。

1.2儀器與液質(zhì)條件API4000 LC/MS/MS聯(lián)用儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，色譜工作站:Analyst 1.4.2;梅特勒-托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司);Drict-Q5超純水機(jī)(法國(guó)Millipore公司)。

液相條件:色譜柱:Agilent ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm，5 μm);流動(dòng)相 ∶甲醇 ∶乙腈∶醋酸銨緩沖液(5 mmol·L-1醋酸銨，0.2%冰醋酸)(15 ∶60 ∶25，V/V/V);流量:0.8 ml·min-1;柱溫:40℃。

質(zhì)譜條件:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧離子化;離子極性:負(fù)離子;離子選擇通道:甘草次酸，［MH］-，m/z 469.4/355.2;潑尼松龍，［M-H］-，m/z 358.9/279.9;離子源電壓:4 000 V;離子源溫度:500℃。

1.3受試者選擇20名男性健康受試者，經(jīng)體檢合格，簽署知情同意書，并經(jīng)倫理委員會(huì)審批同意。實(shí)驗(yàn)前兩周及實(shí)驗(yàn)期間未服用其它任何藥物。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)受試者早晨空腹口服甘草酸二銨膠囊150 mg，用250 ml溫開水送服;服藥2 h后方可飲水，4 h后進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。于服藥前及服藥后2、4、6、8、9、10、11、12、16、24、32、40、48、60 h 分別采血4 ml于肝素化試管中，分離出血漿，于-75℃保存待測(cè)。

1.5血漿樣品的處理于試管中精密加入血漿樣品0.5 ml、內(nèi)標(biāo)潑尼松龍溶液(0.0794 mg·L-1)30 μl，旋渦 10 s，加入 4 ml乙酸乙酯，旋渦振蕩 3 min，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層有機(jī)相 3.5 ml，40℃下空氣吹干，加入80%甲醇100 μl溶液復(fù)溶，旋渦 2 min，12 000 r·min-1離心 5 min，吸取上清液進(jìn)行 LC-MS/MS 分析，進(jìn)樣量5 μl。。

Fig 1 Representative MRM chromatograms of GA and IS in human plasma samples

1.6數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析將實(shí)驗(yàn)所得的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用DASver1.0軟件中“臨床藥理”模塊進(jìn)行處理，計(jì)算各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1特異性在本實(shí)驗(yàn)所采用的LC-MS/MS條件下，甘草次酸和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間分別為3.65、0.83 min。

2.2介質(zhì)效應(yīng)考察取離心管數(shù)支，分別精密加入4.32，0.432，0.0864 mg·L-1的甘草次酸質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液(0.0794 mg·L-1)30 μl，80% 甲醇溶液 50 μl旋渦 1 min，進(jìn)樣分析，記錄峰面積A1。

另按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作提取空白血漿數(shù)管，揮干后同上操作，記錄峰面積A2。

A2和A1的比值(A2/A1×100%)即為介質(zhì)效應(yīng)ME(%)。甘草次酸和內(nèi)標(biāo)介質(zhì)效應(yīng)分別在95.63% ～108.82%(n=3)和77.13%(n=9)。

2.3線性范圍取玻璃試管數(shù)支，加入空白血漿0.5 ml，分別精密加入不同濃度的甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，旋渦10 s混勻，配成含甘草次酸濃度分別為1.50，3.00，6.00，12.0，24.0，48.0，96.0，192 μg·L-1的含藥血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作。計(jì)算甘草次酸峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)，以峰面積比值f對(duì)血藥濃度C作回歸計(jì)算，得回歸方程:f=0.15×C+0.00684，r=0.99965，權(quán)重系數(shù)w=1/C×C。藥物濃度與峰面積間線性關(guān)系良好，線性范圍為1.50～192.0 μg·L-1，最低定量限為 1.50 μg·L-1。

2.4精密度與準(zhǔn)確度考察日內(nèi)精密度與日間精密度(3 d)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含甘草次酸分別為 3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度。實(shí)測(cè)濃度的RSD即為精密度，加入濃度和實(shí)測(cè)濃度的比值即為準(zhǔn)確度，結(jié)果見Tab 1。

2.5提取回收率試驗(yàn)同上操作制備含甘草次酸分別為 3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，記錄峰面積A3。

提取回收率R% =A3/A2×4/3.5×100%，結(jié)果甘草次酸提取回收率在77.14%～83.64%(n=5)。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)甘草次酸和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液室溫放置4h，以甘草次酸峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值計(jì)算，經(jīng)與立即測(cè)定同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，比值變化在95.68% ～103.75%之間;甘草次酸和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液冷藏(5℃)放置60 d，以峰面積計(jì)算，經(jīng)與當(dāng)天新稱量配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，甘草次酸和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液峰面積分別為新配制的98.63%和97.53%(重量經(jīng)校正)，結(jié)果表明甘草次酸和內(nèi)標(biāo)溶液室溫放置4 h和冷藏(5℃)60 d穩(wěn)定性良好。

Tab 1 Precision and accuracy of glycyrrhetic acid in human plasma

分別考察了含甘草次酸濃度分別為3.456，17.28，172.8 μg·L-1的含藥血漿質(zhì)控樣品在室溫放置4 h以及經(jīng)“血漿樣品處理方法”后的分析物放置24 h、-75℃放置20 d及反復(fù)凍融3次條件的穩(wěn)定性，經(jīng)實(shí)測(cè)濃度與加入濃度進(jìn)行比較，濃度變化在88.70%～115%，結(jié)果表明甘草次酸在上述條件下均穩(wěn)定。

2.7人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究20名健康受試者空腹口服甘草酸二銨膠囊150 mg后，血漿中甘草次酸平均濃度-時(shí)間曲線見Fig 2，其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見Tab 2。

Fig 2 Average plasma concentration-time curves after a single oral administration of Diammonium Glycyrrhizinate Capsule to 20 healthy volunteers

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of glycyrrhetic acid in 20 healthy volunteers with a single oral administration of Diammonium Glycyrrhizinate Capsule(xˉ±s，n=20)

3 討論

參照文獻(xiàn)［3-4，6］建立的 LC-MS 甘草次酸檢測(cè)方法應(yīng)用于人體血漿檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)干擾較多，文獻(xiàn)［4，6］中血漿的內(nèi)源性成分和代謝產(chǎn)物干擾了甘草次酸的測(cè)定;實(shí)驗(yàn)考察了不同比例甲醇-水、乙腈-水及甲醇-乙腈-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所建立的流動(dòng)相能有效地將甘草次酸和內(nèi)源性成分及代謝產(chǎn)物分離。文獻(xiàn)［5］雖然建立了LC-MS/MS方法檢測(cè)血漿中甘草酸及甘草次酸，但沒有應(yīng)用于臨床甘草次酸血藥濃度測(cè)定，其最低定量限10 μg·L-1不能滿足甘草次酸常規(guī)血藥濃度檢測(cè)，且血漿樣品處理采用了固相萃取，不適合于臨床藥代動(dòng)力學(xué)大批量血漿樣品檢測(cè)。本研究建立的LC-MS/MS方法具有靈敏度高、干擾少、樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)可滿足臨床的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

甘草酸二銨是甘草酸的銨鹽，在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為甘草酸，甘草酸在體內(nèi)再代謝為甘草次酸而顯現(xiàn)藥理活性，這一轉(zhuǎn)化依賴腸道正常菌群水解，且進(jìn)行緩慢［1，7］。腸內(nèi)菌群在受到各種因素的影響后會(huì)出現(xiàn)一些變化，如個(gè)體胃腸道排空速度不同，胃腸道pH對(duì)藥物的吸收，飲食結(jié)構(gòu)突然改變，抗菌藥物的使用，各種各樣的疾病，特別是消化道疾病，氣候變化，季節(jié)轉(zhuǎn)換，精神狀態(tài)不同等，盡管臨床試驗(yàn)方案對(duì)諸如受試者的一般健康狀況、飲食、用藥等予以控制，但一些不定因素還是會(huì)導(dǎo)致腸內(nèi)菌群存在個(gè)體差異，必然使個(gè)體對(duì)甘草酸的吸收、代謝和排泄存在差異。試驗(yàn)結(jié)果甘草次酸AUC、Cmax、Tmax變異系數(shù)達(dá)到了30%左右和藥-時(shí)曲線的雙峰現(xiàn)象正體現(xiàn)了甘草酸體內(nèi)變化的復(fù)雜性。臨床應(yīng)用甘草酸二銨時(shí)，提示應(yīng)視個(gè)體因素，包括疾病、飲食、合并用藥特別是抗生素應(yīng)用等情況加以分析，制定合理的給藥方案。

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