“芩部丹”中三種單體對結(jié)核分枝桿菌作用下TLR2表達的影響

王莉新，吳燕燕，王 易

(上海中醫(yī)藥大學免疫學與病原生物學教研室，上海 201203)

中醫(yī)臨床驗方“芩部丹”(由黃芩、百部、丹參組方)系上海市龍華醫(yī)院邵長榮醫(yī)生創(chuàng)立的抗癆方藥。據(jù)已有資料顯示，“芩部丹”作為醫(yī)院制劑用于治療對抗結(jié)核化療藥物產(chǎn)生耐藥性的開放性肺結(jié)核患者，痰菌陰轉(zhuǎn)率可高達47%;治療難治性肺結(jié)核患者，痰菌陰轉(zhuǎn)率可達34.5%，均見較明顯的臨床療效［1］。

但此方除方中黃芩被證實具有一定的抑制結(jié)核桿菌生長作用外，其抗癆作用機制始終未能闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)通過對病原體相關分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)的識別而在固有免疫中發(fā)揮主導作用。已有研究表明這類受體在結(jié)核分枝桿菌入胞以及入胞后的轉(zhuǎn)歸中起重要作用［2］。其中TLR2與結(jié)核分枝桿菌入胞過程的關系尤為密切。故此實驗研究設想，“芩部丹”臨床藥效的發(fā)揮，可能與其所含成分對TLR2受體在宿主細胞上之表達有關。此實驗選取目前國內(nèi)可獲取之黃芩、百部、丹參的主要提取物黃芩苷(baicalin)、對葉百部堿(tuberostemonine)、丹參多酚酸鹽(salvianolate)作為研究對象，以觀察這些成分對TLR2的影響作用，揭示“芩部丹”可能的抗結(jié)核免疫藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及細菌人單核-巨噬細胞系U937，由上海交通大學醫(yī)學院免疫研究所惠贈;結(jié)核分枝桿菌H37Ra，由上海復旦大學遺傳學研究所惠贈。

1.1.2藥物單體及主要試劑黃芩苷、對葉百部堿單體購自上海同田生物技術有限公司;注射用丹參多酚酸鹽由上海綠谷制藥有限公司提供，100 mg·瓶-1;RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自Promega公司;TRIzol reagent購自 Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit和 SYBR Premix Ex TaqTM均購自TaKaRa公司;PCR引物序列通過Oligo6軟件設計，并由生工生物工程(上海)有限公司合成;Anti-Human TLR2 FITC及對應的同型對照購自eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)用含體積分數(shù)為0.10的ADC 7H9培養(yǎng)液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周觀察1次，一般1～2周可見瓶底有顆粒生長，10～15 d達到對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期細菌用含有體積分數(shù)為0.10的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整濃度為 1 ×108·L-1。

1.2.2細胞培養(yǎng)U937細胞按常規(guī)方法用含有體積分數(shù)為0.10的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將U937細胞密度調(diào)整為5×108·L-1，經(jīng)終濃度為100 nmol·L-1PMA刺激48 h后，分化為巨噬細胞(以鏡下細胞形態(tài)為確定依據(jù))。棄去培養(yǎng)液，重新調(diào)整細胞密度為1×109·L-1，2 ml/孔鋪于6孔板中，設對照組(Control)、模型組(Model)、黃芩苷組(Baicalin)、對葉百部堿組(Tuberostemonine)、丹參多酚酸鹽組(Salvianolate)5組，每組3復孔。

1.2.3細胞感染模型的制備及藥物干預細胞和細菌按照上述方法培養(yǎng)后，于模型組及用藥組中，按照細胞∶細菌=10∶1加入細菌，將兩者共培養(yǎng)24 h，建立細胞感染模型。兩者共培養(yǎng)24 h后，換液，其中黃芩苷組、對葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組換用含藥(終濃度為10 mg·L-1)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物作用8 h和24 h后，收集細胞，分別進行相關指標檢測。

1.2.4TLR2 mRNA表達水平檢測收集藥物作用8 h后細胞，常規(guī)提取細胞總RNA。取細胞總RNA 5 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，分別進行熒光定量PCR反應。引物序列如下:TLR2(F:CTGGCCAAAGTCTTGATTGAT，R:GACATTCCGACACCGAGAG);GAPDH(F:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R:GGTGCTAAGCAG TTGGTGGT)。反應條件為:95℃預變性30 s，1個循環(huán);95℃變性5 s，60℃ 退火20 s，共40個循環(huán)。用Rotor-Gene 6.0.38軟件讀取各個樣本的Ct值，結(jié)果以 2-ΔΔCt值表示。

1.2.5TLR2蛋白表達水平檢測收集藥物作用24 h后細胞，以FACS法檢測TLR2蛋白表達水平。按照說明書加入適量Anti-Human TLR2，避光孵育30 min后，PBS洗兩次，以 200 μl含體積分數(shù)為0.02多聚甲醛的PBS重懸細胞。于BD公司流式細胞儀上進行檢測并讀取數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均以±s來表示，應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1“芩部丹”對TLR2 mRNA表達的影響實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組TLR2的mRNA表達水平降低(P＜0.05);與模型組相比，黃芩苷組、對葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組TLR2的mRNA表達水平均增高(P＜0.05)。提示黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽均可以糾正因結(jié)核分枝桿菌感染所造成之TLR2 mRNA表達下調(diào)的現(xiàn)象。見Fig 1，2。

Fig 1 The mRNA expression of TLR2 in U937

2.2“芩部丹”對TLR2蛋白表達的影響實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組TLR2的蛋白表達水平降低(P＜0.05);與模型組相比，黃芩苷組、對葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組TLR2的蛋白表達水平均增高(P＜0.05)。提示黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽均可以糾正因結(jié)核分枝桿菌感染所造成之TLR2蛋白表達下調(diào)的現(xiàn)象。見Fig 3，4。

Fig 2 The amplification curve of TLR2 by RT-QPCR

Fig 3 The protein expression of TLR2 in U937

以上研究結(jié)果均提示，“芩部丹”中3種單體黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽的臨床抗結(jié)核療效，有可能與其提高巨噬細胞表面受體TLR2表達的作用相關聯(lián)。

3 討論

自1994年發(fā)現(xiàn)人類TLRs以來，TLRs因其對病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的識別作用和介導多種免疫細胞激活的生物學效應，日益受到免疫學界的關注。并對其機制進行了較深入的研究。此外也發(fā)現(xiàn)了相當數(shù)量的藥物，尤其是中藥成分(多糖、黃酮、三環(huán)二萜類)對TLRs的表達具有調(diào)節(jié)作用［3］。這也促成了以TLRs為靶點治療感染性、免疫性疾病觀點的形成。TLR2與結(jié)核分枝桿菌入胞關系密切，并可識別結(jié)核分枝桿菌表面的阿拉伯糖甘露糖脂和磷脂酰肌醇甘露聚糖等，進而激活抗原提呈，調(diào)節(jié)固有免疫及適應性免疫［4-7］。有研究發(fā)現(xiàn)［8］，敲除小鼠 TLR2基因，然后讓小鼠感染結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染2 h內(nèi)，中性粒細胞浸潤明顯減少，并且IL-6、TNF和IL-12 p40分泌亦下降，說明小鼠對結(jié)核分枝桿菌的易感性增加。同時，Harding等［9］發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌表面脂蛋白LpqH、LprG及LprA可與巨噬細胞表面TLR2結(jié)合，從而抑制APC MHCⅡ類分子表達，令APC提呈抗原的能力下降，使結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)存活下來。這些現(xiàn)象均表明，TLR2在結(jié)核感染過程中起到了非常重要的作用。

Fig 4 The protein expression of TLR2 by FACS

王莉新等［10］在前期研究中發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽對人巨噬細胞表面的模式識別分子產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，而黃芩苷化學結(jié)構(gòu)亦屬于能夠?qū)逃忻庖吲c炎癥反應產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的黃酮類?？紤]到這些已觀察到或已被文獻報道的藥效作用，推論所選取的芩部丹單體黃芩苷、丹參多酚酸鹽有可能影響人巨噬細胞TLR2的表達。出于同一推論，此實驗亦曾對丹參酮ⅡA進行相同研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)對TLR2表達的影響。此實驗研究還顯示黃芩苷可直接提高人巨噬細胞TLR2的表達(結(jié)果另文發(fā)表)，而丹參多酚酸鹽與對葉百部堿僅表現(xiàn)為可拮抗因結(jié)核分枝桿菌感染所造成之TLR2蛋白表達下調(diào)現(xiàn)象。提示此二者真正的作用部位可能是巨噬細胞內(nèi)對TLR2表達的負反饋調(diào)節(jié)通路，今后將繼續(xù)就此開展深入研究。

中藥提取物用作體外細胞水平的藥效研究，其劑量確定是一個公認的難題，因為細胞培養(yǎng)液中所添加的藥物含量很難對應于臨床給藥劑量，本實驗參照抗腫瘤藥物敏感性試驗的相關文獻［11］。將單體含量按估算設置于臨床生藥用量范圍之內(nèi)，采用可觀察到陽性結(jié)果的最低用藥量(因在不同提取物濃度作用條件下，靶細胞所測數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)典型劑量-反應曲線)。其顯示的結(jié)果僅表明在設定實驗條件下，所選用的中藥單體可對人巨噬細胞表面TLR2的表達產(chǎn)生影響。同時，因尚未發(fā)現(xiàn)可引起類似生物學作用的合適化合物，故實驗未能設置陽性對照，但這并不影響實驗結(jié)果觀察的客觀性。

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