miR-143對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及對(duì)Bcl-2表達(dá)的調(diào)節(jié)

劉立鵬，于瀟華，王曉春，郭小芳，田 智，龍 昱，粟 敏，羅玥佶，黃春霞，胡桔紅，吳新華，宋元達(dá)

(1.長沙醫(yī)學(xué)院生化教研室，湖南長沙 410219;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，湖南長沙 410013;4.中南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化系，湖南長沙 410013)

microRNAs是一類非編碼的小分子RNA，越來越多的證據(jù)證明microRNAs在細(xì)胞增殖或凋亡［1］、細(xì)胞分化［2］、生殖［3］以及腫瘤發(fā)病機(jī)制［4］中都具有一定的調(diào)控作用。越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在著特異性表達(dá)的microRNAs，并且其中的一些microRNAs參與調(diào)控了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

宮頸癌是全球高發(fā)的女性惡性腫瘤之一，但目前我們對(duì)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚缺乏全面和深入的了解。最新的研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs在腫瘤［5］、心血管［6］、糖尿病［7］等多種疾病中發(fā)揮重要的作用，其機(jī)制可能與某些microRNAs調(diào)控的疾病相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。通過 PICTAR5、PICTAR4、PITA、RNA22、TargetScan等軟件，我們查到Bcl-2是miR-143的預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究 miR-143在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建miR-143和anti-miR-143高表達(dá)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)情況，并觀察HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的變化情況，雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-143的靶位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料胎牛、小牛血清，杭州四季青生物有限公司;RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，美國Gibco公司;HeLa細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;總RNA提取試劑盒(TRzol法)，Invitrogen公司;RT試劑盒，美國MBI公司;PCR試劑盒，天根生化科技有限公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒，Invitrogen公司;嘌呤霉素，Sigma公司;引物合成，上海生工有限公司;載體 miRNASelectTMpEGP-miR，miRNASelectTMpEP-miR vector，美國 Cell Biolabs公司;Bcl-2 抗體，Santa Cruze;細(xì)胞凋亡 ELISA檢測(cè)試劑盒，Roche公司;Taq Man MicroRNA Assays，ABI公司;Dual-luciferase reporter gene system，Promega公司;pMIR-REPORT載體，Ambion公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、pre-miR-143以及pre-anti-miR-143質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于添加體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。根據(jù)miR-143的前體序列，DNA合成技術(shù)得到第一鏈DNA，接著通過PCR擴(kuò)增得到雙鏈DNA，插入載體miRNASelectTMpEGP-miR，鑒定構(gòu)建質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α宿主菌。體外合成的anti-miR-143前體序列以及對(duì)照組miRNA，也用同樣方法插入載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。用10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞24 h，換為優(yōu)化培養(yǎng)基，并加入配好的脂質(zhì)復(fù)合體，5 h后換成10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)染48 h后加入嘌呤霉素篩選陽性克隆。qRT-PCR檢測(cè)miR-143的表達(dá)情況，根據(jù)ABI公司提供的Taq Man MicroRNA Assays試劑盒中的說明書，利用試劑盒中miR-143和U6 RNA特異性頸環(huán)結(jié)構(gòu)引物檢測(cè)細(xì)胞中成熟的miR-143，ABI7300實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析，U6 RNA作為內(nèi)參。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞長到50%融合時(shí)更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞周期同步化24 h，后加10%胎牛血清，在12 h，24 h，48 h分別加入10×MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用Elx-800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570 nm吸光度值。

1.2.3ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將pre-miR-143，preanti-miR-143以及對(duì)照miRNA組的高表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，按細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)試劑盒的說明提取細(xì)胞質(zhì)組蛋白/DNA片段，加入組蛋白抗體包被的酶標(biāo)板與之免疫雜交1 h，清洗去除未雜交的溶液后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的DNA抗體與之結(jié)合1 h，清洗去除未結(jié)合的溶液后加入過氧化物酶底物溶液反應(yīng)30 min，加入1 mol·L-1H2SO4中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405 nm測(cè)吸光度。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，定量，與上樣緩沖液按比例混勻，100℃煮5 min，8%SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。加入二抗，37℃孵育45 min，TBST洗滌3次，每次15 min，在暗室中壓片，然后顯影、定影。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 分別提取總RNA，定量后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，上游引物序列為5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'，上游引物序列為5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，擴(kuò)增長度為480 bp，其PCR條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)后再72℃終末延伸5 min;Bcl-2的上游引物序列5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3'，下游引物序列為 5'-CCGCTAGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'，擴(kuò)增長度為 318 bp，PCR條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、57.9℃退火30 s、72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后再 72℃延伸5 min。取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6雙螢光素酶報(bào)告基因 將Bcl-2 3'UTR中與miR-143結(jié)合的預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)序列(CAUCUCA)進(jìn)行點(diǎn)突變，將A突變成G，將其插入pMIR-REPORT載體，構(gòu)建pMIR-Bcl-2-mut質(zhì)粒。同樣將Bcl-2 3'UTR插入pMIR-REPORT載體，構(gòu)建pMIR-Bcl-2質(zhì)粒。在24孔板中接種細(xì)胞，將 pMIR-Bcl-2，pMIRBcl-2-mut或者pMIR-REPORT連同 pre-miR-143或者對(duì)照miRNA組高表達(dá)質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，載有海腎熒光素酶的pRL-TK載體也被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中作為對(duì)照。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞裂解，取50 μl的熒光素酶測(cè)試試劑Ⅱ(LARⅡ)10 μl的細(xì)胞裂解液在測(cè)量管中混勻，放入螢光儀中測(cè)量螢火蟲螢光素酶的活力，隨后加入50 μl Stop＆Glo Reagent，吹打混勻，測(cè)量海腎螢光素酶的活力，利用Turner Designs，Spreadsheet Interface Version 2.0.1 進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)處理用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖qRT-PCR結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，并且穩(wěn)定表達(dá)(Fig 1A)。MTT試驗(yàn)如Fig 1B所示，轉(zhuǎn)染了miR-143高表達(dá)質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞的增殖情況受到抑制，而轉(zhuǎn)染了anti-miR-143的HeLa細(xì)胞增殖情況受到促進(jìn)，并且在24 h之后出現(xiàn)明顯變化，與對(duì)照miRNA組相比，轉(zhuǎn)染了miR-143的HeLa細(xì)胞，在24 h和48 h其增殖抑制率分別降低了13.54%、18.63%;而轉(zhuǎn)染了anti-miR-143的HeLa細(xì)胞分別增加了9.38%、13.66%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-143抑制HeLa細(xì)胞增殖。

2.2ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡，如Fig 2所示，相對(duì)于對(duì)照miRNA組，miR-143促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且在24 h之后產(chǎn)生明顯的促凋亡作用，而anti-miR-143能夠削弱這種促凋亡作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-143促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。

2.3miR-143對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示(Fig 3):與control miRNA組相比，轉(zhuǎn)染了miR-143高表達(dá)質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中Bcl-2蛋白明顯減少，降低了21.31%，而轉(zhuǎn)染了anti-miR-143的HeLa細(xì)胞組中，Bcl-2蛋白升高了22.71%。結(jié)果提示在HeLa細(xì)胞中，過表達(dá)的miR-143降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，而anti-miR-143能夠減弱這種抑制作用。

2.4miR-143對(duì)Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響RTPCR結(jié)果顯示(Fig 4)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了premiR-143高表達(dá)質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞組中，Bcl-2mRNA表達(dá)水平改變很小，并且轉(zhuǎn)染了pre-anti-miR-143的HeLa細(xì)胞組中Bcl-2 mRNA的表達(dá)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明miR-143不影響B(tài)cl-2 mRNA的表達(dá)。

Fig 1 Effect of MiR-143 on HeLa cell proliferation in vitro

Fig 2 Detection of HeLa cell apoptosis by ELISA

Fig 3 Detection of Bcl-2 protein expression by Western blot

Fig 4 Detection of Bcl-2 mRNA expression by RT-PCR

Fig 5 Detection of the target sites of miR-143 by dual-luciferase reporter gene assay

2.5miR-143打靶Bcl-2 3'UTR序列雙螢光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照miRNA組，轉(zhuǎn)染了pre-miR-143和pMIR-Bcl-2高表達(dá)質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞熒光素酶的活性明顯降低，然而在含有pMIR-Bcl-2-mut和 pre-miR-143的HeLa細(xì)胞中，熒光素酶的活性的變化不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Bcl-2可能是miR-143的一個(gè)靶位點(diǎn)。

3 討論

現(xiàn)有研究證明，microRNAs的異常表達(dá)參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。本文通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-143抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡;miR-143在HeLa細(xì)胞中對(duì)Bcl-2蛋白具有明顯的調(diào)節(jié)作用，而antimiR-143則促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá);進(jìn)一步的研究證實(shí)，miR-143對(duì)HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，至少部分是通過打靶Bcl-2 3'UTR實(shí)現(xiàn)的。

miR-143是最近研究比較多的一種microRNAs，研究表明其在腫瘤發(fā)生中具有一定的調(diào)節(jié)作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-143 在結(jié)腸癌［8］，肺癌［9］，前列腺癌［10］中低表達(dá)，在肝癌［11］中高表達(dá)。其中在前列腺癌中 miR-143參與調(diào)節(jié) MYO6的表達(dá)［10］，ERK5是miR-143的一個(gè)直接靶位點(diǎn)，miR-143通過打靶ERK5抑制細(xì)胞增殖［12］。在結(jié)腸癌中，miR-143的高表達(dá)降低細(xì)胞增殖和克隆形成的能力，并且DNMT3A是miR-143的一個(gè)直接作用靶點(diǎn)，miR-143調(diào)節(jié)DNMT3A的表達(dá)［13］。近年來研究結(jié)果顯示，microRNAs在宮頸癌中具有一定的調(diào)節(jié)作用。Cheng等［14］發(fā)現(xiàn)miR-218能夠抑制 HeLa細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在 HeLa細(xì)胞系中，過表達(dá)的miR-214能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，并且穩(wěn)定過表達(dá)miR-214的HeLa細(xì)胞系中，miR-214下調(diào)MEK3和JNK1蛋白和mRNA的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明，miR-214通過打靶MEK3和JNK1的3'端非翻譯區(qū)抑制其表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-214可能通過打靶MEK3和JNK1 mRNA的非編碼區(qū)抑制HeLa細(xì)胞的增殖［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-143對(duì) HeLa細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，miR-143能夠抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-143在很多種腫瘤中差異性表達(dá)，提示miR-143有可能成為腫瘤診斷、治療及預(yù)后的新靶標(biāo)。

Bcl-2是凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2過度表達(dá)與多種上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可導(dǎo)致DNA受損的細(xì)胞持續(xù)生存、突變產(chǎn)物聚集。有研究發(fā)現(xiàn)［16］，Bcl-2蛋白的表達(dá)與宮頸癌擴(kuò)散的發(fā)展直接相關(guān)，并且Bcl-2的表達(dá)與子宮頸上皮內(nèi)瘤的臨床分期直接相關(guān)［17］。目前，有研究也發(fā)現(xiàn)，很多 microRNAs調(diào)控Bcl-2的表達(dá)，例如，miR-181a通過打靶Bcl-2增加人惡性膠質(zhì)瘤的輻射敏感度［18］;miR-29可能通過Mcl-1和Bcl-2參與的線粒體途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［19］;miR-15b和miR-16至少部分通過打靶Bcl-2調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而在胃癌多藥耐藥的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［20］。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-143明顯降低Bcl-2蛋白表達(dá)，但對(duì)Bcl-2 mRNA的影響較小，然而轉(zhuǎn)染anti-miR-143則明顯增加Bcl-2蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-143，Bcl-2與HeLa細(xì)胞增殖及凋亡的關(guān)系，我們利用雙螢光素酶報(bào)告基因分析法驗(yàn)證了miR-143至少部分通過打靶Bcl-2 3'UTR并抑制其蛋白質(zhì)表達(dá)，影響HeLa細(xì)胞增殖和凋亡。

本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)miR-143至少部分通過打靶Bcl-2抑制 HeLa細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)凋亡，結(jié)合miR-143和Bcl-2的其他研究，我們可以發(fā)現(xiàn)，miR-143至少是某些腫瘤發(fā)生過程中活性較強(qiáng)的microRNAs，miR-143的差異性表達(dá)能夠影響不同的蛋白質(zhì)，同時(shí)Bcl-2也可以與不同的microRNAs產(chǎn)生相互的作用，進(jìn)而影響體內(nèi)的生理病理過程，我們的實(shí)驗(yàn)再一次驗(yàn)證了microRNAs與蛋白質(zhì)表達(dá)之間的多重對(duì)應(yīng)的關(guān)系，該結(jié)果提示體內(nèi)的microRNAs可能存在一個(gè)網(wǎng)絡(luò)式結(jié)構(gòu)，與其反式作用因子共同調(diào)節(jié)各種生理過程。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為我們進(jìn)一步研究探索microRNA對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)作用及其臨床治療提供了理論依據(jù)。

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