脊髓c-Jun在NMDA受體NR2B亞基介導(dǎo)的大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用

傅 璐，郭瑞鮮，莫利求，崔 宇，趙春梅，胡 芬，陳培熹，馮鑒強(qiáng)，

(中山大學(xué)1.中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2.附屬第一醫(yī)院黃浦院區(qū)麻醉科，廣東廣州 510080;3.廣東省東莞衛(wèi)生學(xué)校，廣東東莞 523018)

慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，深入研究其機(jī)制具有重要的臨床意義。研究證實(shí)［1-2］，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，應(yīng)用NMDA受體拮抗劑可以減弱嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，但其具體機(jī)制迄今尚未完全清楚。

NMDA 受體由 NR1、NR2(A、B、C、D)亞基組成，其中含有NR2B亞基的NMDA受體與疼痛的傳導(dǎo)密切相關(guān)［3］。腦室內(nèi)注射NR2拮抗劑明顯減輕福爾馬林引起的大鼠疼痛［4］。在骨癌痛模型中，小鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)NR2B表達(dá)均明顯增多［5］。導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)注射NR2B拮抗劑可明顯降低外周持續(xù)性的炎性疼，而在小鼠后爪注射完全弗氏佐劑，導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)NR2B明顯增加，但是NR2A卻沒有改變［6］。

在原代培養(yǎng)的成年大鼠海馬的祖細(xì)胞，NMDA受體拮抗劑可抑制c-Jun和c-Fos的表達(dá)［7］。在原代培養(yǎng)的大鼠紋狀體細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞，NMDA通過(guò)興奮谷氨酸受體激活JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase)［8］。本實(shí)驗(yàn)室研究證明［9-10］，嗎啡鎮(zhèn)痛耐受可激活大鼠脊髓背角的NMDA受體NR2B亞基，非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑MK-801可抑制慢性嗎啡引起的JNK激活及嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。上述結(jié)果提示，NMDA受體位于JNK和c-Jun信號(hào)通路的上游，因此，本文推測(cè)，c-Jun可能介導(dǎo)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。本實(shí)驗(yàn)旨在探討:(1)探討嗎啡鎮(zhèn)痛耐受時(shí)能否激活脊髓c-Jun;(2)p-c-Jun主要在脊髓哪種類型的細(xì)胞表達(dá);(3)c-Jun是否參與NR2B介導(dǎo)的嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。

1 材料與方法

1.1主要試劑鹽酸嗎啡購(gòu)自青海制藥有限公司;Ro256981購(gòu)自Sigma公司;p-c-Jun和c-Jun兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自Cell Signal Technology公司。

1.2慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受大鼠模型的建立實(shí)驗(yàn)采用成年Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，體質(zhì)量250～280 g，尾部完好，由中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心提供。每天早上9:00鞘內(nèi)注射10 μl嗎啡(生理鹽水溶解，1.5 g·L-1)一次，連續(xù)7 d，建立慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受大鼠模型，對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。

1.3實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物隨機(jī)分為4組:① 生理鹽水+生理鹽水(NS+NS)組;② 生理鹽水+嗎啡(NS+Mor)組;③ Ro256981+生理鹽水(Ro+NS)組;④Ro256981+嗎啡(Ro+Mor)組。鞘內(nèi)注射2 g·L-1Ro256981(生理鹽水溶解)10 μl，連續(xù) 7 d。每天上午9:00給藥。各組均在第1種藥物注射后30 min再給予第2種藥物。每組6只大鼠用于行為學(xué)測(cè)定和免疫組織化學(xué)染色。

1.4大鼠鞘內(nèi)置管術(shù)根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究方法鞘內(nèi)置管［10］，簡(jiǎn)單的說(shuō)，將預(yù)先充滿生理鹽水的PE10管插入第5椎間隙。將導(dǎo)管朝頭端方向插入2～2.5 cm，使導(dǎo)管末端位于脊髓腰膨大水平。以4-0手術(shù)線分層縫合肌肉與皮膚。大鼠術(shù)后恢復(fù)4 d后開始實(shí)驗(yàn)。術(shù)后出現(xiàn)后肢或尾部癱瘓、運(yùn)動(dòng)功能障礙的動(dòng)物從實(shí)驗(yàn)中排除。

1.5免疫組織熒光染色大鼠給藥d 7行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，立即腹腔注射過(guò)量苯巴比妥鈉(100 mg·kg-1)麻醉大鼠。用預(yù)冷的生理鹽水250 ml和0.66 mol·L-1多聚甲醛500 ml灌注。將腰段脊髓(L4～L6)即腰膨大取出，后固定2 h后置入蔗糖。冰凍切片機(jī)切片，片厚20 μm。依次加入兔抗大鼠c-Jun多克隆抗體(1∶400)，生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶400);0.1 mol·L-1過(guò)氧化氫溶液;ABC復(fù)合物(1∶200);DAB溶液。各步驟間用TBS沖洗3遍。常規(guī)脫水，透明，封片。

免疫熒光雙標(biāo)染色與前述方法類似，混合一抗:兔抗大鼠p-c-Jun多克隆抗體(1∶400)和小鼠抗大鼠神經(jīng)元標(biāo)記物(NeuN)單克隆抗體(1∶400)或小鼠抗大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(OX-42，1∶400)或小鼠抗大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)單克隆抗體(1∶400)和混合二抗:Cy3標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(1∶400)FITC標(biāo)記的羊抗小鼠熒光二抗(1∶400)。各步驟間均用 TBS沖洗。室溫、避光孵育2 h，O-lympus熒光顯微鏡下觀察并照相，放大倍數(shù)為×20。陰性對(duì)照為一抗稀釋液代替一抗。免疫組織化學(xué)定量分析見先前我們的研究［11］，簡(jiǎn)單的說(shuō)，每只大鼠隨機(jī)取五個(gè)脊髓切片，用Image J軟件對(duì)脊髓背角(Ⅰ-Ⅳ)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。

1.6行為學(xué)測(cè)試按照國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的方法［10］，實(shí)施嗎啡鎮(zhèn)痛作用的行為學(xué)測(cè)試，即在d 1、d 3、d 5、d 7鞘內(nèi)注射嗎啡后30 min，用熱水(50±0.2)℃甩尾法測(cè)定甩尾潛伏期(TFL)。打藥前為基礎(chǔ)閾值(BL)，打藥后為鎮(zhèn)痛閾值(TL)。據(jù)最大效應(yīng)百分率(the percentage of maximal possible antinociceptive effect，%MPE)=(TL-BL)/(cut-off time-BL)×100%計(jì)算比較行為學(xué)結(jié)果。

1.7定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用One-way ANOVA及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1慢性嗎啡處理激活脊髓背角的c-Jun免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，正常大鼠的脊髓存在少量p-c-Jun的陽(yáng)性細(xì)胞。

Fig 1 Chronic intrathecal morphine treatment for 7 consecutive days upregulated p-c-Jun in the spinal dorsal horn of rats

連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射嗎啡后，大鼠脊髓中的p-c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較NS+NS組的明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，F(xiàn)ig 1 a，b，g)。但是在連續(xù)7 d鞘內(nèi)給藥后，NS+Mor組大鼠的脊髓背角中的t-c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與NS+NS組的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，F(xiàn)ig 1 d，e，h)。

Fig 2 Localization of p-c-Jun in spinal dorsal horn

2.2慢性嗎啡處理誘導(dǎo)的p-c-Jun在脊髓神經(jīng)元中表達(dá)為了確定脊髓背角p-c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞類型，對(duì)p-c-Jun分別與神經(jīng)元標(biāo)記物(NeuN)、星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(OX-42)進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。結(jié)果表明，在連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射嗎啡后，嗎啡鎮(zhèn)痛耐受大鼠的脊髓p-c-Jun主要在神經(jīng)元中表達(dá)，而小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞均沒有p-c-Jun的表達(dá)(Fig 2)。

2.3NR2B選擇性拮抗劑Ro256981抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受熱水甩尾法測(cè)痛結(jié)果表明，NS+Ro組的最大效應(yīng)百分率(%MPE)與NS+NS組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，F(xiàn)ig 3)，表明Ro256981本身無(wú)鎮(zhèn)痛作用。注射嗎啡d 1和d 3，NS+Mor組和Ro+Mor組均產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用(P＜0.01)。注射d 5 NS+Mor組鎮(zhèn)痛作用下降(P＜0.01)，提示嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成，而Ro+Mor組的鎮(zhèn)痛作用比NS+Mor組強(qiáng)(P＜0.01)。到注射d 7，NS+Mor組的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)一步減弱，基本上無(wú)鎮(zhèn)痛作用(P＞0.05)，但Ro+Mor組大鼠仍有明顯的鎮(zhèn)痛作用，與NS+Mor組相比有差異(P＜0.01)。以上結(jié)果提示，連續(xù)鞘內(nèi)注射嗎啡7 d可產(chǎn)生嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，而Ro256981可以部分逆轉(zhuǎn)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。

2.4NR2B選擇性拮抗劑Ro256981抑制大鼠脊髓背角c-Jun的激活免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，給藥第7 d各實(shí)驗(yàn)組脊髓背角c-Jun的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，F(xiàn)ig 1 d，e，f，h)。值得注意的是，Ro+Mor組脊髓p-c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較NS+Mor組的明顯減少(P＜ 0.01，F(xiàn)ig 1 b，c，g)，提示Ro256981可能通過(guò)抑制c-Jun的激活來(lái)抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。

Fig 3 Effect of intrathecal administration of Ro256981 on morphine antinociceptive tolerance assessed by tail flick test(ˉx ± s，n=6)

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)NMDA受體各亞基功能的深入研究，特別是與痛覺產(chǎn)生和調(diào)制密切相關(guān)的NR2B在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受及內(nèi)臟痛覺敏化中的作用日益受到重視［12］。慢性嗎啡耐受明顯上調(diào)小鼠脊髓NMDA受體NR2B亞基的表達(dá)［13］。本實(shí)驗(yàn)室最近的研究證實(shí)，嗎啡鎮(zhèn)痛耐受時(shí)，大鼠脊髓背角NMDA受體NR2B亞基的表達(dá)明顯增加，NMDA受體非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑MK-801可明顯地抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，且也能抑制慢性嗎啡處理引起的NR2B表達(dá)增多，提示大鼠脊髓的NMDA受體NR2B亞基可能介導(dǎo)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受［9］。為了進(jìn)一步探討NR2B在嗎啡耐受形成中的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了NR2B選擇性抑制劑Ro256981對(duì)嗎啡耐受的影響。結(jié)果表明Ro256981能顯著地阻斷嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，進(jìn)一步表明NR2B介導(dǎo)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。有報(bào)道指出，抑制大腦前回NMDA受體NR2B亞基也可以抑制嗎啡鎮(zhèn)痛耐受［14］。結(jié)合本文及我們最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9-10］，可以看出，NR2B可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同水平參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。

重要的是，本文證實(shí)，嗎啡鎮(zhèn)痛耐受時(shí)可激活大鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun。Schwargschild等［8］觀察到，在原代培養(yǎng)的大鼠紋狀體和小腦顆粒細(xì)胞，NMDA受體可通過(guò)激活JNK信號(hào)通路，進(jìn)一步激活A(yù)P-1，而且導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的表達(dá)。在體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元的模型中，c-Jun可以促進(jìn)NR2B基因的轉(zhuǎn)錄［15］。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NMDA受體位于c-Jun的上游，NMDA受體與c-Jun可能存在著相互作用的關(guān)系，即NMDA受體可促進(jìn)c-Jun表達(dá)，而c-Jun也可促進(jìn)NR2B亞基的轉(zhuǎn)錄。因此，本文推斷c-Jun可能參與NR2B介導(dǎo)的嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。為此，本文探討NR2B選擇性抑制劑Ro256981對(duì)c-Jun表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，Ro256981在拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的同時(shí)，也明顯地抑制c-Jun磷酸化，提示NR2B-c-Jun通路的激活可能是大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的機(jī)制之一。在原代培養(yǎng)的大鼠海馬祖細(xì)胞中，NMDA受體拮抗劑地佐環(huán)平明顯抑制了c-Jun和c-Fos的表達(dá)［7］，這為本文的結(jié)果提供了有力的支持。

綜上所述，嗎啡鎮(zhèn)痛耐受能夠激活大鼠脊髓背角神經(jīng)元內(nèi)的c-Jun，活化的c-Jun參與NMDA受體NR2B亞基介導(dǎo)的嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。本文為深入闡明嗎啡鎮(zhèn)痛耐受機(jī)制提供了新的證據(jù)，為臨床防治嗎啡鎮(zhèn)痛耐受提供了新的藥物靶點(diǎn)。

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