五味子乙素對(duì)染矽塵大鼠肺組織一氧化氮水平和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)變化的影響

樊林花，劉田福，郭 民，劉茂林

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，山西太原 030001)

石英粉塵可使機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，而使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，誘發(fā)巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)［1］。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種氧化劑、一種炎癥介質(zhì)在氧化應(yīng)激和組織損傷過程中的作用已得到越來越多證明［2］。體內(nèi)過量NO主要由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化產(chǎn)生［3］。iNOS基因上游有多種核轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，其中最主要的是核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)［4］，前期研究表明，Sch-B對(duì)染矽塵大鼠肺損傷有保護(hù)作用［5］，可抑制NF-κB的活化［6］，我們推測(cè) Sch-B可能參與 iNOS的表達(dá)過程。為進(jìn)一步探討其抑制染矽塵大鼠肺損傷的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了Sch-B對(duì)染矽塵大鼠肺組織NO水平和iNOS表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑Sch-B(成都曼斯特生物科技有限公司，純度 ＞98%);SiO2(美國 Sigma公司，純度99%;用生理鹽水配成50 g·L-1混懸液經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，用前加青霉素20 000 U·L-1);RNAiso Plus總RNA提取試劑、RT試劑盒、Taq酶和dNTP(寶生物工程大連有限公司);iNOS和GAPDH引物序列由北京奧科生物公司合成;NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2主要儀器PTC-200PCR儀、水平電泳儀、凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)，微量離心機(jī)(德國eppendorf公司)，高速冷凍離心機(jī)3-18K(美國Sigma公司)，萊卡切片機(jī)(德國Laica公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)，T6新世紀(jì)型紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)

1.3動(dòng)物分組、模型建立及標(biāo)本的收集選用我中心前期復(fù)制的大鼠實(shí)驗(yàn)性矽肺模型石蠟塊，共96例。對(duì)照組(Control)、染矽塵組(Silica)和Sch-B組(Sch-B)各32例，采用暴露式氣管內(nèi)注入法染塵，染矽塵組和Sch-B組每只大鼠注入1 ml SiO2混懸液，對(duì)照組注入1 ml滅菌生理鹽水。染塵后d 1 Sch-B組開始灌胃給予Sch-B 8 mg·(100 g)-1·d-1，其余各組給予等容橄欖油。每周復(fù)查體重，調(diào)整給藥劑量。各組于給藥后d 3、7、14和28隨機(jī)取8只，腹主動(dòng)脈采血致死，經(jīng)右心灌注生理鹽水沖洗肺內(nèi)血液，生理鹽水漂洗，記錄肉眼病理變化。取左肺中段用于HE染色，其余肺組織于液氮中速凍后存于-80℃冰箱，以備RT-PCR和肺組織NO測(cè)定。

1.4肺組織NO含量的測(cè)定采用硝酸還原酶法，按照試劑盒說明書操作。

1.5肺組織病理學(xué)檢查石蠟切片作HE染色觀察肺組織基本病理學(xué)改變。

1.6RT-PCR檢測(cè)肺組織中iNOS mRNA表達(dá)剪取凍存的肺組織100 mg，按RNAiso Plus試劑說明書操作，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參照。iNOS上游引物:5'-GCATCCCAAGTACGAGTGGT-3';下游引物:5'-CCATGATGGTCACATTCTGC-3'，產(chǎn)物長度308 bp;GAPDH上游引物:5'-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3';下游引物:5'-GATGACCTTGCCCACAGCCTTG-3'，產(chǎn) 物 長 度 213 bp。取2 μ l擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行掃描，分別測(cè)定每一個(gè)目的基因及GAPDH的吸光度值，取iNOS與GAPDH的吸光度比值為iNOS mRNA相對(duì)含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，相同時(shí)間點(diǎn)多組間的比較用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組肺臟組織病理學(xué)變化對(duì)照組大鼠雙肺呈粉紅色，表面光滑柔軟，彈性良好，肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，各觀察點(diǎn)均未出現(xiàn)明顯改變。染矽塵組大鼠肺呈蒼白色，硬度增加，有出血點(diǎn)，表面粗糙不平，彈性減弱，染塵后d 3表現(xiàn)為明顯的炎癥，可見肺泡壁水腫，肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多;d 7肺泡間隔增厚，伴有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增多;d 14肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔變窄，成纖維細(xì)胞增生，膠原基質(zhì)明顯增多，纖維化開始發(fā)生;d 28肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁顯著增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞或消失，肺組織以膠原沉積、肺纖維化改變?yōu)橹鳌ch-B組大鼠肺組織色澤較均勻，表面稍粗糙，彈性尚可，肺組織結(jié)構(gòu)病變程度較同期模型組明顯減輕。

2.2染塵后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織NO含量和iNOS表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化NO含量在染塵后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均明顯升高(P＜0.01)，其中在d 7時(shí)達(dá)到高峰后開始下降，iNOS mRNA的變化與NO含量類似，但iNOS mRNA的峰值出現(xiàn)在d 14(見Tab 1、2)。

2.3Sch-B對(duì)染矽塵大鼠肺組織不同時(shí)間點(diǎn)NO含量和iNOS表達(dá)的作用Sch-B組各時(shí)間點(diǎn)NO含量都明顯低于相應(yīng)的染矽塵組(P＜0.05或P＜0.01);各時(shí)間點(diǎn)iNOS mRNA表達(dá)也都低于相應(yīng)的染矽塵組，但只在d 3和7時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在d 14和28時(shí)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見Tab 1、2 和 Fig 1)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以暴露式氣管內(nèi)注入二氧化硅粉塵復(fù)制了大鼠矽肺纖維化模型，經(jīng)大體肺組織標(biāo)本外觀形態(tài)觀察和HE染色顯示，染矽塵組大鼠病理特征與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］，說明造模成功。Sch-B組與染矽塵組相比，大鼠肺結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，未見明顯纖維化改變，從組織形態(tài)學(xué)角度說明Sch-B對(duì)染矽塵大鼠肺纖維化具有一定的抑制作用。

Tab 1 Effect of Sch-B on NO content in lung homogenates of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

Tab 1 Effect of Sch-B on NO content in lung homogenates of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs silica

Group NO content in lung at different time points/μmol·g-1Pro d 3 d 7 d 14 d 28 Control 1.95±0.43 1.87±0.46 1.79±0.47 1.97±0.48 Silica 4.87±0.45＊＊ 6.21±1.04＊＊ 4.89±1.14＊＊ 5.01±0.74＊＊Sch-B 2.92±0.60＊＊△△ 3.30±0.99＊△△ 3.47±1.22＊＊△ 3.27±0.89＊＊△△

Tab 2 Effect of Sch-B on expression of iNOS mRNA in lung of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

Tab 2 Effect of Sch-B on expression of iNOS mRNA in lung of rats exposed to silica at different time points(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05 vs silica

Group mRNA expression of iNOS in lung at different ti me points d 3 d 7 d 14 d 28 Control 0.12±0.05 0.11±0.08 0.13±0.03 0.10±0.02 Silica 0.37±0.13＊＊ 0.47±0.22＊＊ 0.53±0.20＊＊ 0.33±0.07＊＊Sch-B 0.23±0.12△ 0.21±0.14△ 0.44±0.19＊＊ 0.27±0.11＊＊

Fig 1 Expression of iNOS mRNA in lung tissue of different group rats at different time points

有研究表明［8］，NO參與了矽肺早期的炎癥反應(yīng)過程，并與肺纖維化的形成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:染矽塵組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織NO含量均較相應(yīng)的對(duì)照組明顯升高，說明NO在整個(gè)肺纖維化形成與發(fā)展過程中起一定作用，而Sch-B干預(yù)后NO含量較染矽塵組明顯降低，進(jìn)一步證明Sch-B可通過降低NO水平來干預(yù)早期的肺泡炎癥、改善后期的肺纖維化。

誘導(dǎo)性一氧化氮合酶是一類與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的酶，主要在病理及炎癥狀態(tài)下發(fā)揮作用。在多種炎癥因子、內(nèi)毒素等體液性物質(zhì)的誘導(dǎo)下，iNOS mRNA過量表達(dá)，一旦誘導(dǎo)合成，即可持續(xù)翻譯合成iNOS，催化機(jī)體產(chǎn)生過量 NO［3］，iNOS/NO 體系的變化與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［9，10］。本實(shí)驗(yàn)顯示:染矽塵組各時(shí)間點(diǎn)iNOS mRNA大量表達(dá)，其肺組織NO含量明顯上升，遠(yuǎn)高于各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組大鼠NO水平，說明染矽塵大鼠肺組織NO含量增多可能主要與iNOS mRNA過量表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)還表明，各時(shí)間點(diǎn)肺組織NO含量和iNOS mRNA表達(dá)水平呈動(dòng)態(tài)變化，但兩者峰值在時(shí)間上不具有同步性，NO含量在染塵后7 d時(shí)達(dá)到高峰，而iNOS mRNA表達(dá)水平在染塵后7 d時(shí)明顯升高，14 d時(shí)達(dá)到高峰，這可能是由于實(shí)驗(yàn)樣本量較少所致。經(jīng)Sch-B干預(yù)后，iNOS mRNA表達(dá)水平在d 3和7時(shí)較染矽塵組明顯降低，肺組織NO含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯降低，提示Sch-B在染塵初期對(duì)iNOS的作用明顯，其原因可能是在染塵初期，肺組織損傷主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激和肺泡炎，此時(shí)給予Sch-B干預(yù)能抑制肺組織氧化損傷，降低炎性因子的分泌，進(jìn)而減少對(duì)iNOS的誘導(dǎo)和NO的合成和釋放，但隨著肺泡炎的減輕，肺纖維化的出現(xiàn)，Sch-B對(duì)iNOS的抑制作用不明顯，但對(duì)肺組織NO含量仍有明顯的抑制作用，可能是染塵后期，Sch-B可使NO含量減少是通過減輕炎癥作用導(dǎo)致的，并沒有涉及iNOS的誘導(dǎo)，這有待更深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)闡明了大鼠染矽塵后NO和iNOSmRNA的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及使用Sch-B后對(duì)動(dòng)態(tài)變化的影響，初步探討了Sch-B抑制NO和iNOS mRNA的時(shí)間規(guī)律，這為進(jìn)一步選擇合適時(shí)機(jī)干預(yù)矽肺纖維化進(jìn)程提供依據(jù)，同時(shí)提示Sch-B在染矽初期對(duì)NO的影響，是由于Sch-B抑制了iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其進(jìn)一步作用機(jī)制可能是通過同時(shí)干預(yù)NF-κB的活化水平，最終降低細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)及NO的誘導(dǎo)性合成與釋放，減輕炎癥反應(yīng)程度，而發(fā)揮抗纖維化作用的，但后期NO的降低并不能單純以抑制iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平來解釋。

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