磷脂型DHA對腫瘤細胞凋亡的影響

楊玉紅，王靜鳳，龍騰騰，趙 芹，楊延存，馬 琴，薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003)

流行病學研究結果表明［1］，惡性腫瘤的發(fā)生與攝入脂肪的種類和數(shù)量密切相關。最新研究發(fā)現(xiàn)［2］，來自海洋魚類的DHA等n-3高度不飽和脂肪酸(n-3PUFA)具有很好的降低腫瘤發(fā)病率的作用。磷脂型DHA(DHA-PC)主要存在于烏賊的肌肉和卵中，是一種新型的天然產物，其中，DHA位于磷脂甘油基的C-2。DHA具有廣泛的生理活性，近年來研究發(fā)現(xiàn)DHA有抑癌活性和誘導癌細胞凋亡的作用［3］。磷脂主要存在于動植物細胞的生物膜和原生質中，許多研究表明它具有抗腫瘤和免疫調節(jié)功能［4］。目前已證實DHA-磷脂脂質體對腫瘤有明顯的抑制作用，但其作用機制尚不明確［5］。本研究利用從鳶烏賊卵中提取制備的 DHA-磷脂，觀察了DHA-PC對人肝癌HepG-2細胞凋亡的作用及對裸鼠移植瘤生長的影響，旨在進一步證實DHA-PC的抗腫瘤功效，為其在醫(yī)藥保健領域的開發(fā)提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料BALB/c♂小鼠，17～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號為SCXK(京)2007-0001。

人肝癌細胞系HepG-2和S180肉瘤細胞株，均由山東醫(yī)學科學院細胞生物學研究所提供。HepG-2細胞于 RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。S180以腹水型傳代，取接種后生長良好的S180腹水，生理鹽水稀釋，制備瘤細胞懸液，調整細胞數(shù)至4×109·L-1。

1.2藥品和試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、新生牛血清，由美國Gibco公司提供;膽固醇，由日本和光純藥工業(yè)株式會社提供;吖啶橙(acridine orange，AO)和溴化乙錠(ethidium bromide，EB)，由美國Promega公司提供;環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)，由上海華聯(lián)制藥有限公司提供;其他試劑均為國產分析純。

1.3儀器SFE121-50-02超臨界萃取裝置，江蘇南通華興石油儀器有限公司;6980N型氣相色譜儀，美國Agilent公司;1100型液相色譜儀，美國Agilent公司;LF-1型脂質體制備儀，加拿大AVESTIN公司產品;FACS.VAN.TAGE流式細胞儀，美國BD公司產品;IX51倒置顯微鏡系統(tǒng)(DP72照相系統(tǒng))、BX41熒光顯微鏡系統(tǒng)，Olympus產品;680型酶標儀，日本BIO-RAD公司產品;Bj5060UV型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司產品。

1.4實驗方法

1.4.1DHA-PC的制備和檢測 鳶卵粉利用超臨界CO2萃取法脫除鳶卵粉中膽固醇［CO2流量為16.7ml·(g·h)-1，萃取釜壓力25M Pa，溫度45℃，萃取時間2 h］，再將上述脫膽固醇的鳶烏賊卵粉利用丙酮脫除中性脂(料液比:1∶15)后，加入95%乙醇提取卵粉中磷脂，高效液相色譜法測得該產物中PC的含量為90%［6］，采用氣相色譜法對其進行脂肪酸分析，測得其中DHA含量為30%。

1.4.2DHA-PC脂質體的制備 將DHA-PC與等摩爾的膽固醇用少量三氯甲烷溶于茄形瓶中，充入氮氣保護，旋轉蒸發(fā)成均勻薄膜，用生理鹽水震蕩混勻，經(jīng)超聲波處理形成乳白色的懸濁液，得到DHA-PC脂質體。

1.4.3對腫瘤細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HepG-2細胞，按2×103cells/well接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的DHA-PC脂質體(0、250、275、300、325、350、375 和 400 μmol·L-1)分別培養(yǎng)48、72、96 h后，加 MTT溶液(終濃度為0.5 g·L-1)，于37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入酸化異丙醇200 μl/well，吹打至藍色結晶完全溶解，于酶標儀570 nm處檢測OD值，并計算IC50值。

1.4.4細胞凋亡的形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期的HepG-2細胞，按2×105cells/well接種于6孔培養(yǎng)板。貼壁24 h后加入不同濃度的DHA-PC脂質體(0、500 和1 000 μmol·L-1)。48 h 后，收集細胞，PBS洗滌2次。將細胞稀釋至1010·L-1，取100 μl細胞懸液，加入4 μl AO/EB(1 ∶1V/V)，輕輕吹打混勻后取10 μl滴于載玻片上，蓋玻片封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.5流式細胞術檢測細胞周期分布 取對數(shù)生長期的HepG-2細胞，按2×105cells/well接種于6孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度的 DHA-PC 脂質體(0、600 和1 200 μmol·L-1)。作用48 h后，收集細胞，用PBS洗2次，輕輕打勻細胞，加預冷的75%乙醇固定24 h，PBS洗滌2次后，加入碘化丙錠(PI)染液，4℃避光染色20 min后進行流式細胞儀檢測。

1.4.6荷瘤小鼠模型的建立和動物實驗 BALB/c小鼠于右腋窩皮下接種S180瘤細胞懸液，每只0.2 ml。24 h后隨機分為模型對照組、陽性對照組以及DHA-PC低、高劑量組，并設不接種腫瘤的小鼠為正常對照組，每組10只。DHA-PC組小鼠分別灌胃不同劑量的DHA-PC脂質體(以其中所含DHA為對照確定灌胃劑量，分別為50和200 mg·kg-1)。陽性對照組灌胃Cy(20 mg·kg-1)。正常及模型對照組灌胃生理鹽水，灌胃體積為0.01 ml·g-1，每天1次，連續(xù)14 d。小鼠末次給藥后禁食不禁水12 h，分別稱重，脫頸椎處死，仔細剝離肉瘤稱重，并計算抑瘤率:抑瘤率/%=(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.5統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析，同時進行LSD兩兩比較，實驗結果用±s表示。

2 結果

2.1對HepG-2細胞生長的抑制作用DHA-PC脂質體作用48 h后，對HepG-2細胞生長有抑制作用，并且隨作用濃度的增加和時間的延長而遞增，具有一定的量效和時效關系(Fig 1)。經(jīng)擬合計算，HepG-2細胞經(jīng)DHA-PC脂質體分別作用48、72和96 h 的 IC50值為 411.11、388.22 和 355.66 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of DHA-PC on proliferation of HepG-2

2.2對HepG-2細胞凋亡的影響AO能透過細胞膜完整的細胞嵌入DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。EB僅能透過細胞膜受損的細胞嵌入DNA，發(fā)橘紅色熒光。染色后，正常細胞核染色質著均勻的綠色;早期凋亡細胞核染色質著綠色，呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細胞核染色質為橘紅色，呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的壞死細胞核染色質著均勻的紅色［7］。

正常對照組細胞核染色質著綠色，核形態(tài)結構正常。經(jīng)DHA-PC脂質體低劑量處理48 h后，可見細胞核固縮，出現(xiàn)早期凋亡特征;而高劑量組可見細胞被EB染成紅色，核形態(tài)與早期凋亡細胞相似，為濃染的紅色碎片(核碎裂)或凋亡小體(如Fig 2箭頭所示)，核染色質出現(xiàn)著橙色并呈固縮狀，為晚期凋亡的形態(tài)(Fig 2)。表明DHA-PC具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

2.3對HepG-2細胞周期的影響DHA-PC可明顯影響HepG-2細胞的周期分布。與正常對照組相比，不同劑量DHA-PC作用48 h后，細胞SubG1+G0/G1比例明顯增加，分別較正常對照組提高了3.4%和21.83%;細胞S期變化不明顯，G2/M期明顯減少;DHA-PC低、高劑量組在G1期前均出現(xiàn)典型的凋亡峰，分別高出正常組1.95%和25.88%(見Tab 1和Fig 3)。表明DHA-PC能夠改變細胞的周期，將細胞阻滯在G0/G1期，使其無法進入S期和M期，抑制細胞增殖。

Fig 2 Effects of DHA-PC on apoptotic morphology of HepG-2(40×object)

Fig 3 Effects of DHA-PCon the cell cycle distribution of HepG-2

2.4對S180荷瘤小鼠抑瘤率的影響不同劑量的DHA-PC均能抑制小鼠S180肉瘤的生長。其中DHA-PC組低、高劑量的抑瘤率分別為33.53%和48.35%，見Tab 2。表明DHA-PC在體內具有較好的抑制腫瘤生長的作用。

Tab 1 Effects of DHA-PCon the cell cycle distribution of HepG-2

Tab 2 Effects of DHA-PC on growth of tumor in mice(n=10，±s)

Tab 2 Effects of DHA-PC on growth of tumor in mice(n=10，±s)

＊＊P＜0.01 vs model control group

Model control - 1.864±0.233 -Positive control 20 0.866±0.033＊＊53.53±1.76 DHA-PC medium dosage 50 1.240±0.05＊＊ 33.53±2.88 DHA-PC high dosage 200 0.960±0.06＊＊48.35±2.4

3 討論

近年來，DHA和磷脂及其衍生物的抗腫瘤作用受到了廣泛關注。許多研究證明［8-11］DHA能抑制直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的增殖，減慢移植瘤生長，并能誘導腫瘤細胞凋亡。林彬等［12］的研究證實DHA能進入細胞內抑制HepG-2細胞的生長增殖并誘導其凋亡。磷脂具有兩親分子結構，是細胞膜的構成物質之一，能夠與細胞膜結合，因此結合有磷脂的物質更易于通過細胞膜進入細胞內發(fā)揮作用。DHA的磷脂分子能夠以結合形態(tài)由細胞直接攝取，在細胞內分解為DHA與磷脂，顯示出增效作用［13］。目前已證實［14］，DHA-磷脂對細胞分化具有誘導作用。本實驗MTT結果顯示，DHA-PC能夠抑制HepG-2細胞的生長和抑制小鼠S180肉瘤的生長，說明DHA-PC具有明顯的抑瘤效應。

大量研究證實，細胞周期調控異常與細胞癌變密切相關。細胞分化的主要標志是合成特異性的功能蛋白，出現(xiàn)細胞類型的功能性改變，同時進行細胞表型的形態(tài)結構變化，這些標志性變化均在G1期由細胞分化完成。腫瘤細胞去分化的一個重要特征就是G1→S期卡點失常，進入 S期的細胞異常增多［15-16］。本實驗結果表明，DHA-PC可使 HepG-2細胞周期停滯于G0/G1期，提示DHA-PC對HepG-2細胞的增殖抑制作用與其改變細胞周期分布，減少DNA合成和有絲分裂，促進腫瘤細胞分化有關。另外，細胞周期的調節(jié)既影響細胞分裂又影響細胞凋亡，許多凋亡的刺激信號在細胞凋亡之前可誘發(fā)細胞周期阻滯，與此同時，細胞周期調控的異常也被視為腫瘤發(fā)生的一個重要原因，因此，通過細胞周期阻滯來誘導細胞凋亡成為抗腫瘤的一個新靶點［17-19］。樓健穎等［20］報道DHA對胃癌細胞AGS的增殖具有明顯抑制作用，且AGS經(jīng)DHA處理后細胞阻滯于G0/G1期，并誘發(fā)明顯的凋亡峰。本實驗結果也證實，DHA-PC能夠誘發(fā)HepG-2細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。由此，我們認為DHA-PC是通過細胞周期阻滯抑制HepG-2細胞增殖、并誘導細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

目前，DHA-PC抑制腫瘤細胞增殖的機制引起了國內外學者的廣泛關注。Kafrawy等［21］研究了DHA-PC對于體外培養(yǎng)的T27A鼠白血病細胞的作用，發(fā)現(xiàn)DHA-PC能夠結合到細胞膜上并改變其結構，從而抑制腫瘤細胞的生長。Hossain等［22］報道DHA-PC能夠誘導CaCO-2細胞適度凋亡，發(fā)現(xiàn)與凋亡有關的DNA得到降解，證實這種天然物質對于癌細胞的凋亡有較高的生物活性。細胞凋亡是一個多階段、多系統(tǒng)參與的極其復雜的過程，有關DHA-PC對細胞周期進程中相關基因和蛋白表達的影響及其具體的分子機制尚在進一步的研究中。

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