復方黃芪金銀花顆粒的質(zhì)量標準研究

翟少欽，曹國文，李成君

(重慶市畜牧科學院獸醫(yī)研究所，重慶 402460)

復方黃芪金銀花顆粒是重慶市畜牧科學院獸醫(yī)研究所根據(jù)中醫(yī)理論研制的治療雞傳染性法氏囊病的中藥復方制劑。為更好地控制其在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量，對復方黃芪金銀花顆粒進行了質(zhì)量標準的研究，以期為復方黃芪金銀花顆粒投入生產(chǎn)進行質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器、對照品及化學試劑

1.1 儀器 超聲波清洗機:KQ－3200E型，昆山超聲波儀器有限公司;三用紫外儀:ZF－2型，上海安亭電子儀器廠;電子天平:BS25S型，德國賽多利斯儀器有限公司，d=0.01 mg;雙光束紫外可見分光光度計:TU－1901型，北京普析通用儀器有限公司;硅膠 G、H板:青島海洋化工廠分廠，批號20100201、20091211。

1.2 對照品 齊墩果酸對照品:A0117，純度≥98%(滴定法);綠原酸對照品:A0022，純度≥98%(HPLC);女貞子對照藥材:121041－200302;枸杞子對照藥材:121072－200806;黃芪甲苷對照品:A0070，純度≥98%(HPLC)。均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 試劑 所有化學試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 女貞子 取本品5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，冷卻，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇－三氯甲烷(3∶2)混合溶液1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺失女貞子的顆粒，同法制成陰性對照溶液。另取齊墩果酸對照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液3～5 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈(365 nm)下檢視，記錄結(jié)果。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點［1－3］(圖1)。

圖1 女貞子薄層鑒別圖

2.1.2 枸杞子 取本品6.0 g，研細，加水100 mL，超聲40 min，放冷，過濾，取濾液，用乙酸乙酯50 mL提取，分取乙酸乙酯，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取枸杞子對照藥材1 g，加水50 mL，超聲30 min，放冷，過濾，取濾液，用乙酸乙酯30 mL振搖提取。分取乙酸乙酯溶液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL，作為對照藥材溶液。另取陰性對照樣品(缺失枸杞子藥材)，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－三氯甲烷－甲酸(3∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下觀察。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無相同顏色的斑點［1，4－5］(圖 2)。

圖2 枸杞子薄層鑒別圖

2.1.3 金銀花 取本品10 g，加三氯甲烷30 mL，超聲提取2次，每次20 min，濾過，合并濾液，濾液蒸干，用1 mL乙醇溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為陽性對照品溶液。取缺失金銀花的顆粒照上法提取，作為陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H板上，以乙酸乙酯－甲酸－水(7 ∶2.5 ∶2.5)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈下(365 nm)檢視，供試品色譜中，在與對照品綠原酸色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照色譜上則無［1，6－7］(圖 3)。

圖3 金銀花薄層鑒別

2.1.4 黃芪 取本品3 g，加50 mL水超聲提取40 min，濾液加乙醚提取2次，每次20 mL，乙醚液棄去，水液置水浴上加熱揮去醚，放冷，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉試液洗2次，每次40 mL，洗液棄去，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品1 mg，加甲醇2 mL，溶解，作為對照品溶液;取缺失黃芪的顆粒照上法提取，作為陰性對照溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開(展距12 cm)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，110℃烘干，在紫外光燈(365 nm)下檢視，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點［1，8－9］(圖4)。

圖4 黃芪薄層鑒別圖

2.2 綠原酸的含量測定

2.2.1 吸收波長的選擇

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品13.00 mg置25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液溶解定容至刻度作為總儲備液。取總儲備液2.5 mL定容至25 mL得儲備液。分別精密量取儲備液2、2.5、3、3.5、4 mL 定容至25 mL，即為標準對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取本品于研缽中研細，精密稱取5.0 g，置25 mL容量瓶中，加50%的甲醇溶液20 mL，超聲處理30 min，冷至室溫，50%的甲醇溶液加至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液5 mL，用50%的甲醇溶液定容至25 mL，搖勻，即為供試液。

2.2.1.3 光譜掃描 取標準品溶液及供試品溶液適量，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，得最大吸收波長為328 nm。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取上述不同濃度的標準對照品溶液，搖勻后在328 nm處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，以濃度(C)(μg/mL)為橫坐標，得直線回歸方程:A=0.0053×C －0.0012(r=0.9999，n=5)。結(jié)果表明，綠原酸在 42.24 ～84.48 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(圖5)。

圖5 綠原酸標準曲線

2.2.3 精密度試驗 取總儲備液1 mL，用50%甲醇溶液定容至100 mL，在328 nm處測定吸光度，重復5次，相對標準偏差(RSD)為0.382%。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品5份，同法制備，分別在 0、2、4、6、24 h 時在 328 nm 處測定吸光度，計算RSD值。結(jié)果RSD=0.733%，表明該方法在24 h內(nèi)很穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品0.5 g，精密稱定，再精密加入一定量的綠原酸對照品，按供試液的制備方法同法制備，在328 nm處測定吸光度，計算回收率(表1)。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.6 含量測定 精密稱取同一批次供試品0.5 g，共6份，按供試品溶液制備法制備，在328 nm處測定吸光度，結(jié)果綠原酸的平均含量為660.6792 μg/g。

3 討論

3.1 薄層鑒別 在研究女貞子的薄層鑒別時，根據(jù)參考文獻資料［2－3］選擇了幾種方法進行比較。首先是供試液的制備，文獻資料上都用的是加熱回流，采用這種方法，用時較長，操作不方便，于是改為超聲處理，過濾后取濾液，這樣時間大大地縮短了，而且超聲提取比較完全;在進行薄層展開時，采用過以正己烷－三氯甲烷－乙酸乙酯－冰乙酸(17∶10 ∶3 ∶0.3)為展開劑，結(jié)果噴以 5%香草醛乙酸－高氯酸(1∶4)溶液顯色后，供試品與對照品的斑點不在同一位置，且放在365 nm紫外光燈觀察時沒有相應(yīng)的斑點。后改用以環(huán)己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈(365 nm)下檢視，結(jié)果出現(xiàn)很清晰的薄層色譜圖，重現(xiàn)性更好，陰性樣品無干擾。

在研究枸杞子的薄層色譜鑒別時，參考文獻資料［4－5］選擇了幾種方法進行比較。首先是供試液的制備，文獻資料上都用的是加熱回流，冷卻，靜置一段時間后取上清液。采用這種方法，用時較長，提取不完全，不利于生產(chǎn)實際應(yīng)用，所以改為超聲處理，過濾后取濾液，這樣時間大大地縮短了，而且超聲提取比較完全;其次是溶劑方面，文獻資料上提取的溶劑有乙醚、三氯甲烷，而本試驗選擇水。乙醚和三氯甲烷都是有毒液體，特別是乙醚具有很強的揮發(fā)性，極易燃且具有麻醉性，所以在不影響檢測結(jié)果的情況下，選擇了更為安全的水作為溶劑。在展開劑的選擇上，曾選用過甲苯－乙醚－冰乙酸(體積比10∶10∶0.1)和三氯甲烷－乙酸乙酯－苯－甲酸(5∶6∶3∶1)2種展開劑，但是相比于乙酸乙酯－三氯甲烷－甲酸(3∶2∶1)，后者的展開效果更好，圖像更清晰，重現(xiàn)性更好，陰性樣品無干擾。

在研究金銀花的薄層色譜鑒別時，參考文獻資料［6－7］選擇了幾種方法進行比較。供試液的制備方法中將水浴加熱回流改為超聲處理，這樣用時短，操作便捷，有利于生產(chǎn)實際應(yīng)用;其次是薄層板的選擇。大量文獻資料用的都是硅膠G板，但是在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，用硅膠G板進行復方黃芪金銀花顆粒中金銀花的鑒別時，出現(xiàn)陰性樣品干擾，所以將硅膠G板改為硅膠H板，這樣在同樣的條件下，硅膠H板展開效果更好，圖像更清晰，重現(xiàn)性更好，陰性樣品無干擾。

在研究黃芪的薄層鑒別［8－9］時，曾使用三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(10∶20∶11∶5)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，發(fā)現(xiàn)目標斑點Rf值偏低，換用三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑后，發(fā)現(xiàn)斑點較為圓整，且Rf值比較合理。

3.2 含量測定方面 綠原酸為酚酸類成分，具有良好的水溶性。但由于分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽和鍵及多元酚而不穩(wěn)定，綠原酸水溶液易發(fā)生水解和氧化反應(yīng)，雖然在制備供試溶液時使用的是50%甲醇溶液，但也應(yīng)該將樣品溶液貯存在避光低溫的環(huán)境中，試驗過程中應(yīng)盡量避光操作，最好選擇棕色的容器。

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